Diagnosi di cancro del colon-retto e adenoma avanzato mediante firme di metilazione specifiche del cancro

1. Contesto della ricerca

   1.1 Diagnosi del cancro del colon-retto Il cancro del colon-retto è un comune tumore maligno dell'apparato digerente. Secondo le statistiche del 2015, sia la morbilità che la mortalità del cancro del colon-retto in Cina sono tra i primi cinque di tutti i tumori. Gli studi hanno dimostrato che il tasso di sopravvivenza a cinque anni dei pazienti può raggiungere il 90% se i pazienti vengono diagnosticati prima della diffusione delle cellule tumorali. Tuttavia solo il 40% dei pazienti viene attualmente diagnosticato in fase iniziale. Pertanto, il trattamento nella fase iniziale della malattia è un mezzo necessario per far fronte al cancro del colon-retto. Il metodo principale utilizzato clinicamente per la diagnosi è la colonscopia. Questo metodo è accurato, ma limitato da molti fattori, come diarrea, perforazione intestinale, e deve essere preparato in molti modi prima dell'esame. I pazienti devono seguire una dieta fluida, pulire l'intestino, ecc. Altri metodi diagnostici come l'imaging, l'esame istopatologico hanno un basso tasso di rilevamento o causano danni all'organo. Pertanto, è un compito ancora impegnativo rilevare il cancro del colon-retto in una fase iniziale.

   1.2 Rilevazione della metilazione del ctDNA in pazienti affetti da cancro del colon-retto e studi clinici L'epigenetica si riferisce a un cambiamento fenotipico ereditario senza un cambiamento nella sequenza primaria del DNA. La metilazione del DNA è una delle vie di modificazione epigenetica, che può causare cambiamenti nella struttura della cromatina e nella stabilità del DNA e regolare la trascrizione e l'espressione genica. Gli studi hanno scoperto che la metilazione del DNA ha una stretta relazione con l'insorgenza e lo sviluppo di tumori. I cambiamenti della metilazione del DNA si verificano in numerosi siti del DNA nelle cellule tumorali rispetto alle cellule normali. Ulteriori studi dimostrano che la metilazione del DNA si verifica all'inizio del processo del cancro, rendendo possibile l'utilizzo della metilazione del DNA per lo screening precoce del cancro.

   Sulla base del documento di ricerca pubblicato dal professor Kun Zhang su Nature Genetics, Singlera Genomics Inc. ha inventato la tecnologia proprietaria di sequenziamento del metil-titano e ha sviluppato un metodo di rilevamento per il cancro colorettale e l'adenoma avanzato (Adenoma/Colorectal cancer Early detection, ACE). L'ACE è una tecnica diagnostica non invasiva basata sul sangue. Ha un alto tasso di compliance rispetto alla colonscopia e il campionamento è più conveniente del test delle feci. Ha anche una sensibilità molto più elevata rispetto ai metodi di analisi del sangue esistenti. Sulla base di questi vantaggi, la tecnologia ACE è adatta per la diagnosi precoce del cancro colorettale.

   Durante la fase di sviluppo Singlera Genomics Inc. ha utilizzato un metodo di screening ad alto rendimento e ad alta copertura per 4 milioni di siti di metilazione CpG nel genoma e ha analizzato diversi stadi di cancro del colon-retto, adenoma, campioni di tessuto polipo e tessuti normali accoppiati per lo screening del cancro del colon-retto siti di metilazione correlati. Sono stati analizzati anche campioni di plasma di pazienti affetti da cancro e persone sane per selezionare marcatori di metilazione del ctDNA per il cancro del colon-retto.

   L'attuale studio prevede di utilizzare il metodo ACE per analizzare il ctDNA nel sangue per i marcatori di metilazione del DNA specifici del cancro per aiutare nella diagnosi differenziale dei pazienti con cancro del colon-retto e adenoma. Questa tecnica ridurrà notevolmente il disagio nella diagnosi dei pazienti sospetti e migliorerà la diagnosi della popolazione ad alto rischio di cancro del colon-retto. Il tasso di rilevamento più elevato è vantaggioso per la diagnosi precoce e il trattamento precoce del cancro del colon-retto, che farà effettivamente risparmiare sui costi medici e migliorerà il tasso di sopravvivenza dei pazienti.

2. Obiettivi della ricerca

   2.1. Obiettivi primari Stabilire un sistema di rilevamento basato sulla tecnologia di sequenziamento della metilazione del ctDNA plasmatico per la diagnosi ausiliaria del cancro colorettale e dell'adenoma; Per valutare il valore diagnostico della firma della metilazione del ctDNA plasmatico per il cancro del colon-retto e l'adenoma.

   2.2. Obiettivi secondari Valutare l'associazione dei segnali di metilazione del ctDNA plasmatico con i risultati della colonscopia ei risultati patologici dei campioni chirurgici.

3. Panoramica della ricerca

   3.1 Disegno e pianificazione della ricerca Questo studio era uno studio prospettico, aperto, controllato, multicentrico. I campioni arruolati contengono un gruppo positivo (incluso carcinoma colorettale stadio I-IV, adenoma avanzato) e un gruppo negativo (adenoma non avanzato, pazienti con esame patologico negativo, persone sane con risultati colonscopici negativi, iperplasia benigna e malattia infiammatoria colorettale senza displasia ). Le dimensioni del campione sono: 700 casi positivi e 600 casi negativi.

   3.2 Numero di casi e schema di raggruppamento Questa sperimentazione prevede di arruolare 1300 soggetti, che verranno assegnati in due gruppi. Il gruppo positivo comprende 300 casi di cancro del colon-retto (stadio I-IV) e 400 casi di adenoma avanzato (displasia di alto grado, adenoma villoso, adenoma tubulare, lesioni dentellate, ecc.). Il gruppo negativo (600 casi in totale) comprende: adenomi non avanzati (dimensione ≤10 mm, non meno di 100 casi), malattia infiammatoria del colon-retto, iperplasia benigna, pazienti senza tumore all'esame istopatologico e persone sane normali.

   3.3 Procedura di ricerca

   3.3.1 Screening dei pazienti Il ricercatore chiederà a ciascun soggetto informazioni di base, anamnesi di malattia, anamnesi familiare, anamnesi farmacologica e se ha partecipato o meno a studi clinici correlati per determinare se soddisfa i criteri di inclusione. Sulla base delle loro cartelle cliniche i soggetti che soddisfano i criteri di inclusione vengono prima divisi in un gruppo positivo semplice e un gruppo negativo. Per ogni paziente arruolato verrà firmato un modulo di consenso informato.

   A tutti i soggetti che completano il raggruppamento iniziale verrà prelevato il sangue venoso periferico prima di sottoporsi a colonscopia e gestione clinica. 20 ml del campione di sangue vengono centrifugati secondo i requisiti di separazione del plasma per la rilevazione del ctDNA. Il plasma surnatante viene raccolto e immediatamente refrigerato.

   3.3.2 Esame clinico La colonscopia viene eseguita su tutti i soggetti (eccetto quelli con esiti di patologia chirurgica). Per i pazienti con lesioni intestinali, viene eseguita la colonscopia per determinare se sono positivi o negativi. I pazienti positivi che necessitano di resezione chirurgica saranno ulteriormente classificati in base ai loro risultati istopatologici chirurgici. Per i pazienti negativi va chiarito il tipo di lesione.

   3.3.3 Test ACE Tutti i campioni di plasma dei soggetti assegnati a gruppi specifici vengono trasportati a Shanghai Singlera Genomics Inc. (No. 20, Lane 500, Furonghua Road, Pudong New Area, Shanghai). Il cfDNA viene estratto dal plasma del paziente e viene analizzato il profilo di metilazione del DNA specifico del cancro. In base ai risultati del test di metilazione del ctDNA plasmatico, viene valutato il rischio di cancro del colon-retto dei soggetti arruolati e combinato con le informazioni di raggruppamento per valutare il valore dell'applicazione clinica del profilo di metilazione specifico del cancro nel ctDNA per la diagnosi precoce di cancro e adenoma.

   3.4 Determinazione dell'end point I soggetti positivi sono determinati sulla base dei risultati dell'esame istopatologico chirurgico; i soggetti negativi sono determinati in base ai risultati della colonscopia.

   Il profilo di metilazione del ctDNA viene analizzato per soggetti positivi e negativi.

4. analisi statistica

4.1 Stima della dimensione del campione I risultati di questo studio sono segnali di metilazione specifici del cancro colorettale dal ctDNA del sangue periferico. I segnali di metilazione saranno tutti sovrapposti con un certo peso e il punteggio finale è in un unico numero. I nostri risultati preliminari hanno mostrato che il valore medio del gruppo di controllo (μ1) era 0,36 e il valore medio del gruppo di test (μ2) era 0,73. La differenza media tra i gruppi era δ = μ2 - μ1= 0,37, la deviazione standard σ della deviazione standard complessiva del campione s è 0,42. Impostare il livello di controllo α su 0,005 su entrambi i lati. La prestazione di verifica β è 0,005 e la tabella dei valori t viene interrogata per ottenere t(α) = 2,807, t(β) = 2,576.

La seguente formula viene utilizzata per calcolare la dimensione del campione:

n = 2*((tα + tβ)*S/δ)2

Il risultato calcolato è n = 74,68, che è arrotondato a 75. Considerando che i campioni arruolati possono avere il 25% di casi inutilizzabili, la dimensione minima del campione del gruppo di test è stata fissata a 100 casi.

Positivo gruppo 1, cancro del colon-retto stadio I-IV, non è necessario assegnare gruppi in ciascuna sottocategoria. Considerando il bilanciamento del numero di campioni tra altri gruppi, la dimensione del campione è impostata su 300 casi.

Gruppo positivo 2, adenoma avanzato, secondo le "Linee guida per la diagnosi e il trattamento del cancro del colon-retto", gli adenomi avanzati sono divisi in quattro categorie. Non è necessaria una distribuzione equa in diverse categorie, con una media di 100 casi per categoria, per un totale di 400 casi.

Il gruppo negativo è diviso in tre categorie. Gli adenomi non avanzati devono essere differenziati dagli adenomi positivi nel gruppo positivo 2 e richiedono una dimensione minima del campione di 100 casi. Altre categorie non richiedono una dimensione specifica del campione. Considerando il bilanciamento con altri gruppi, la dimensione del campione è impostata su un totale di 600 casi.

4.2 Statistiche e analisi dei dati I dati di sequenziamento per ciascun campione sono stati valutati per la qualità del sequenziamento utilizzando una varietà di parametri, incluso se i dati di sequenziamento raggiungono un livello preimpostato; se il valore Q30 è accettabile; se il sito CpG è bilanciato, se la copertura è conforme allo standard, se la profondità di sequenziamento dell'amplicone è quella prevista e se l'uniformità del sequenziamento è accettabile.

I segnali di metilazione del DNA specifici del cancro nei risultati del sequenziamento sono riassunti e analizzati secondo il modello stabilito nei nostri studi precedenti. Ogni valore del segnale viene sovrapposto con un certo peso per ottenere un punteggio di metilazione per ogni campione. In combinazione con le informazioni di raggruppamento di ciascun campione, PCA, clustering e altre analisi di classificazione vengono eseguite per ciascun campione. I segnali di metilazione vengono quindi convertiti in un punteggio di rischio di cancro colorettale/adenoma.

Sulla base delle differenze dei punteggi di rischio tra il gruppo negativo e il gruppo positivo, vengono calcolati la sensibilità, la specificità e i valori previsti positivi e viene valutata l'efficacia dell'applicazione clinica del segnale di metilazione specifico del cancro nel ctDNA plasmatico.