使用癌症特异性甲基化特征诊断结直肠癌和晚期腺瘤

1. 研究背景

   1.1 大肠癌的诊断 大肠癌是消化道常见的恶性肿瘤。 据2015年统计，我国结直肠癌的发病率和死亡率均位居所有癌症的前五位。 研究表明，如果患者在肿瘤细胞扩散之前得到诊断，患者的五年生存率可达90%。 然而，目前只有 40% 的患者在早期得到诊断。 因此，早期治疗是应对大肠癌的必要手段。 临床上用于诊断的主要方法是结肠镜检查。 该方法准确，但受限于腹泻、肠穿孔等诸多因素，检查前需要多方准备。 患者需要进食流质饮食，清理肠道等。 其他诊断方法如影像学、组织病理学检查检出率低，或对器官造成损害。 因此，早期发现结直肠癌仍然是一项具有挑战性的任务。

   1.2 结直肠癌患者ctDNA甲基化检测及临床研究 表观遗传学是指在DNA一级序列没有改变的情况下，可遗传的表型变化。 DNA甲基化是表观遗传修饰途径之一，可引起染色质结构和DNA稳定性的改变，调节基因转录和表达。 研究发现，DNA甲基化与肿瘤的发生、发展有着密切的关系。 与正常细胞相比，肿瘤细胞中 DNA 的许多位点都会发生 DNA 甲基化变化。 进一步的研究表明，DNA甲基化发生在癌症发生的早期，使得利用DNA甲基化进行癌症早期筛查成为可能。

   基于张坤教授在Nature Genetics发表的研究论文，Singlera Genomics Inc.发明了专有的甲基-Titan测序技术，开发了结直肠癌和晚期腺瘤的检测方法（Adenoma/Colorectal cancer Early detection，ACE）。 ACE 是一种基于血液的非侵入性诊断技术。 与结肠镜检查相比符合率高，取样比大便化验更方便。 与现有的血液检测方法相比，它的灵敏度也高得多。 基于这些优势，ACE技术适用于结直肠癌的早期诊断。

   在发展阶段，Singlera Genomics Inc.采用高通量、高覆盖率筛选基因组中400万个CpG甲基化位点的方法，分析不同阶段的结直肠癌、腺瘤、息肉组织样本和成对的正常组织，以筛查结直肠癌相关的甲基化位点。 还分析了癌症患者和健康人的血浆样本，以选择结直肠癌的 ctDNA 甲基化标记物。

   目前的研究计划使用 ACE 方法分析血液中的 ctDNA 以寻找癌症特异性 DNA 甲基化标记，以帮助鉴别诊断结直肠癌和腺瘤患者。 该技术将大大降低疑似患者诊断时的不适感，提高结直肠癌高危人群的诊断水平。 较高的检出率有利于大肠癌的早发现早治疗，将有效节省医疗费用，提高患者的生存率。

2. 研究目标

   2.1. 主要目标 建立基于血浆ctDNA甲基化测序技术的检测体系，用于结直肠癌和腺瘤的辅助诊断；评估血浆ctDNA甲基化特征对结直肠癌和腺瘤的诊断价值。

   2.2. 次要目标 评估血浆 ctDNA 甲基化信号与结肠镜检查结果和手术标本病理结果之间的关联。

3. 研究概览

   3.1 研究设计与计划本研究为前瞻性、开放性、对照性、多中心研究。 入组样本包含阳性组（包括I-IV期结直肠癌、晚期腺瘤）和阴性组（非晚期腺瘤、病理检查阴性的患者、结肠镜检查结果阴性的健康人、良性增生和无异型增生的炎性结直肠疾病） ). 样本量为：700 个阳性病例和 600 个阴性病例。

   3.2病例数及分组方案本试验拟入组1300例受试者，分为两组。 阳性组包括结直肠癌（I-IV期）300例，晚期腺瘤（高度异型增生、绒毛状腺瘤、管状腺瘤、锯齿状病变等）400例。 阴性组（共600例）包括：非晚期腺瘤（直径≤10mm，不少于100例）、炎性结直肠疾病、良性增生、组织病理学无瘤患者、正常健康人。

   3.3 研究程序

   3.3.1 患者筛选研究者会询问每个受试者的基本情况、病史、家族史、用药史、是否参加过相关临床试验，以确定是否符合纳入标准。 根据他们的记录，符合纳入标准的受试者首先被分为简单的阳性组和阴性组。 将为每位登记的患者签署知情同意书。

   完成初始分组的所有受试者将在接受结肠镜检查和临床管理之前收集外周静脉血。 取20ml血样，按照ctDNA检测血浆分离要求离心。 收集上清血浆并立即冷藏。

   3.3.2 对所有受试者进行临床检查结肠镜检查（具有手术病理结果的受试者除外）。 对于有肠道病变的患者，进行结肠镜检查以确定它们是阳性还是阴性。 需要手术切除的阳性患者将根据其手术组织病理学结果进一步分类。 对于阴性患者，应明确病变类型。

   3.3.3 ACE检测 分到特定组的受试者的所有血浆样本均被运送至上海新格瑞基因股份有限公司（上海市浦东新区芙蓉花路500弄20号）。 从患者血浆中提取 cfDNA，并分析癌症特异性 DNA 甲基化谱。 根据血浆ctDNA甲基化检测结果，对入组受试者的结直肠癌风险进行评分，并结合分组信息，评估ctDNA中癌症特异性甲基化谱在早期癌症和腺瘤诊断中的临床应用价值。

   3.4 终点判定阳性受试者根据手术组织病理学检查结果确定；根据结肠镜检查结果确定阴性受试者。

   分析阳性和阴性受试者的 ctDNA 甲基化谱。

4. 统计分析

4.1 样本量估计 本研究的结果是来自外周血 ctDNA 的结直肠癌特异性甲基化信号。 甲基化信号都会叠加一定的权重，最后的分数是一个单一的数字形式。 我们的初步结果显示，对照组的平均值（μ1）为0.36，测试组的平均值（μ2）为0.73。 组间平均差为δ=μ2-μ1=0.37，总体样本标准差s的标准差σ为0.42。 将两侧的检查级别 α 设置为 0.005。 验证性能β为0.005，查询t值表得到t(α)=2.807，t(β)=2.576。

以下公式用于计算样本量：

n = 2*((tα + tβ)*S/δ)2

计算结果为n = 74.68， 四舍五入为 75。 考虑到入组样本可能有 25% 的不可用案例，最小测试组样本量设置为 100 个案例。

阳性组1，结直肠癌I-IV期，各亚类无需分组。 考虑平衡其他组间的样本数，样本量设置为300例。

阳性组2，晚期腺瘤，根据《结直肠癌诊治指南》，晚期腺瘤分为四类。 不同类别不需要平均分配，平均每个类别100个案例，总共400个案例。

负组分为三类。 非晚期腺瘤需要与阳性组2中的阳性腺瘤相鉴别，最小样本量为100例。 其他类别不需要特定的样本量。 考虑到与其他组的平衡，样本量设置为总共 600 个案例。

4.2 统计与数据分析对每个样本的测序数据采用多种参数进行测序质量评价，包括测序数据是否达到预设水平； Q30值是否可以接受； CpG位点是否平衡，覆盖度是否达标，扩增子测序深度是否符合预期，测序一致性是否可以接受。

根据我们之前研究建立的模型，对测序结果中的癌症特异性DNA甲基化信号进行总结和分析。 每个信号值与一定的权重叠加以获得每个样本的甲基化分数。 结合每个样本的分组信息，对每个样本进行PCA、聚类等分类分析。 然后将甲基化信号转换为结直肠癌/腺瘤风险评分。

根据阴性组和阳性组的风险评分差异，计算灵敏度、特异度和阳性预测值，评价血浆ctDNA中肿瘤特异性甲基化信号的临床应用效果。