Diagnos av kolorektal cancer och avancerad adenom med hjälp av cancerspecifika metyleringssignaturer

1. Forskningsbakgrund

   1.1 Diagnostik av kolorektal cancer Kolorektal cancer är en vanlig malign tumör i matsmältningskanalen. Enligt statistik från 2015 är både sjuklighet och dödlighet av kolorektal cancer i Kina bland de fem bästa av alla cancerformer. Studier har visat att patienternas femårsöverlevnadsgrad kan uppnå 90 % om patienterna diagnostiseras innan tumörcellerna sprids. Men bara 40% av patienterna diagnostiseras för närvarande i ett tidigt skede. Därför är behandling i det tidiga skedet av sjukdomen ett nödvändigt medel för att klara av kolorektal cancer. Den huvudsakliga metoden som används kliniskt för diagnos är koloskopi. Denna metod är korrekt, men begränsad av många faktorer, såsom diarré, tarmperforation, och måste förberedas på många sätt innan undersökningen. Patienterna behöver äta flytande kost, rengöra tarmarna osv. Andra diagnostiska metoder som avbildning, histopatologisk undersökning har låg upptäcktshastighet eller orsakar skador på organet. Därför är det fortfarande en utmanande uppgift att upptäcka kolorektal cancer i ett tidigt skede.

   1.2 Detektion av ctDNA-metylering hos kolorektalcancerpatienter och kliniska studier Epigenetik avser en ärftlig fenotypisk förändring utan förändring i DNA:ts primära sekvens. DNA-metylering är en av de epigenetiska modifieringsvägarna, som kan orsaka förändringar i kromatinstruktur och DNA-stabilitet, och reglera gentranskription och uttryck. Studier har funnit att DNA-metylering har ett nära samband med förekomst och utveckling av tumörer. DNA-metyleringsförändringar inträffar på många ställen av DNA i tumörceller jämfört med normala celler. Ytterligare studier visar att DNA-metylering sker tidigt i cancerprocessen, vilket gör det möjligt att använda DNA-metylering för tidig screening av cancer.

   Baserat på forskningsrapporten publicerad av professor Kun Zhang i Nature Genetics, uppfann Singlera Genomics Inc. den egenutvecklade metyl-Titan-sekvenseringsteknologin och utvecklade en detektionsmetod för kolorektal cancer och avancerad adenom (Adenoma/Colorectal cancer Early detection, ACE). ACE är en blodbaserad icke-invasiv diagnostisk teknik. Den har hög överensstämmelsegrad jämfört med koloskopi, och provtagning är bekvämare än avföringstestning. Det har också mycket högre känslighet jämfört med befintliga blodprovsmetoder. Baserat på dessa fördelar är ACE-teknologin lämplig för tidig diagnos av kolorektal cancer.

   Under utvecklingsstadiet använde Singlera Genomics Inc. en screeningmetod med hög genomströmning och hög täckning för 4 miljoner CpG-metyleringsställen i genomet och analyserade olika stadier av kolorektal cancer, adenom, polypvävnadsprover och parade normala vävnader för att screena kolorektal cancer -relaterade metyleringsställen. Plasmaprover från cancerpatienter och friska personer analyserades också för att välja ctDNA-metyleringsmarkörer för kolorektal cancer.

   Den aktuella studien planerar att använda ACE-metoden för att analysera ctDNA i blodet för cancerspecifika DNA-metyleringsmarkörer för att hjälpa till med differentialdiagnos av patienter med kolorektal cancer och adenom. Denna teknik kommer att avsevärt minska obehaget vid diagnosen av misstänkta patienter och förbättra diagnosen av högriskpopulationer av kolorektal cancer. Den högre upptäcktsgraden är fördelaktig för tidig upptäckt och tidig behandling av kolorektal cancer, vilket effektivt kommer att spara medicinska kostnader och förbättra patienters överlevnadsgrad.

2. Forskningsmål

   2.1. Primära mål Att etablera ett detektionssystem baserat på plasma-ctDNA-metyleringssekvenseringsteknologi för hjälpdiagnos av kolorektal cancer och adenom; Att bedöma det diagnostiska värdet av plasma-ctDNA-metyleringssignatur för kolorektal cancer och adenom.

   2.2. Sekundära mål Att bedöma sambandet mellan plasma-ctDNA-metyleringssignaler med koloskopiresultat och patologiska resultat av kirurgiska prover.

3. Forskningsöversikt

   3.1 Forskningsdesign och planering Denna studie var en prospektiv, öppen, kontrollerad multicenterstudie. De inskrivna proverna innehåller en positiv grupp (inklusive kolorektal cancer stadium I-IV, framskridet adenom) och en negativ grupp (icke-avancerat adenom, patienter med negativ patologisk undersökning, friska personer med negativa koloskopiresultat, benign hyperplasi och inflammatorisk kolorektal sjukdom utan dysplasi ). Urvalsstorlekarna är: 700 fall positiva och 600 fall negativa.

   3.2 Antal fall och grupperingsplan Denna prövning planerar att registrera 1300 försökspersoner, som kommer att delas in i två grupper. Den positiva gruppen inkluderar 300 fall av kolorektal cancer (stadium I-IV) och 400 fall av avancerad adenom (höggradig dysplasi, villös adenom, tubulär adenom, sågtandade lesioner, etc.). Den negativa gruppen (totalt 600 fall) inkluderar: icke-avancerade adenom (storlek ≤10 mm, inte mindre än 100 fall), inflammatorisk kolorektal sjukdom, benign hyperplasi, tumörfria patienter vid histopatologisk granskning och normala friska människor.

   3.3 Forskningsförfarande

   3.3.1 Patientscreening Forskaren kommer att fråga varje försöksperson om grundläggande information, sjukdomshistoria, familjehistoria, medicinhistoria och om de har deltagit i relaterade kliniska prövningar eller inte för att avgöra om de uppfyller inklusionskriterierna. Baserat på deras register delas de försökspersoner som uppfyller inklusionskriterierna först in i en enkel positiv grupp och en negativ grupp. Ett informerat samtyckesformulär kommer att undertecknas för varje inskriven patient.

   Alla försökspersoner som slutför den initiala grupperingen kommer att få sitt perifera venösa blod insamlat innan de genomgår koloskopi och klinisk behandling. 20 ml av blodprovet centrifugeras enligt kraven för ctDNA-detektionsplasmaseparation. Supernatantplasman samlas upp och kyls omedelbart.

   3.3.2 Klinisk undersökning Koloskopi utförs på alla ämnen (förutom de som har kirurgiska patologiska resultat). För patienter med tarmskador utförs koloskopi för att avgöra om de är positiva eller negativa. Positiva patienter som behöver kirurgisk resektion kommer att klassificeras ytterligare enligt deras kirurgiska histopatologiska resultat. För negativa patienter bör typen av lesion klargöras.

   3.3.3 ACE-testning Alla plasmaprover från försökspersonerna som tilldelats specifika grupper transporteras till Shanghai Singlera Genomics Inc. (nr 20, Lane 500, Furonghua Road, Pudong New Area, Shanghai). cfDNA extraheras från patientplasma och cancerspecifik DNA-metyleringsprofil analyseras. Enligt resultaten av plasma-ctDNA-metyleringstest bedöms risken för kolorektal cancer hos de inskrivna försökspersonerna och kombineras med grupperingsinformation för att bedöma det kliniska tillämpningsvärdet av den cancerspecifika metyleringsprofilen i ctDNA för tidig cancer- och adenomdiagnos.

   3.4 Slutpunktsbestämning De positiva försökspersonerna bestäms baserat på resultaten av kirurgisk histopatologisk undersökning; de negativa försökspersonerna bestäms baserat på koloskopiresultat.

   CtDNA-metyleringsprofilen analyseras för positiva och negativa försökspersoner.

4. Statistisk analys

4.1 Uppskattning av provstorlek Resultaten av denna studie är kolorektal cancerspecifika metyleringssignaler från perifert blod ctDNA. Metyleringssignalerna kommer alla att överlagras med en viss vikt, och slutpoängen är i form av ett enda nummer. Våra preliminära resultat visade att medelvärdet för kontrollgruppen (μ1) var 0,36, och medelvärdet för testgruppen (μ2) var 0,73. Medelskillnaden mellan grupperna var δ = μ2 - μ1= 0,37, standardavvikelsen σ för den totala provets standardavvikelse s är 0,42. Ställ in kontrollnivån α till 0,005 på båda sidor. Verifieringsprestandan β är 0,005, och t-värdestabellen frågas för att erhålla t(α) = 2,807, t(β) = 2,576.

Följande formel används för att beräkna provstorleken:

n = 2*((tα + tp)*S/5)2

Det beräknade resultatet är n = 74,68, som avrundas till 75. Med tanke på att de inskrivna proverna kan ha 25 % oanvändbara fall, sattes den minsta provstorleken för testgruppen till 100 fall.

Positiv grupp 1, kolorektal cancer stadium I-IV, inget behov av att tilldela grupper i varje underkategori. Med tanke på att balansera antalet urval mellan andra grupper är urvalsstorleken satt till 300 fall.

Positiv grupp 2, avancerad adenom, enligt "Riktlinjer för diagnos och behandling av kolorektal cancer" delas de avancerade adenomen in i fyra kategorier. Det finns inget behov av lika fördelning i olika kategorier, med i genomsnitt 100 ärenden per kategori, totalt 400 ärenden.

Den negativa gruppen delas in i tre kategorier. Icke-avancerade adenom måste skiljas från positiva adenom i positiv grupp 2 och behöver en provstorlek på minst 100 fall. Andra kategorier kräver ingen specifik urvalsstorlek. Med hänsyn till balansering med andra grupper är urvalsstorleken satt till totalt 600 fall.

4.2 Statistik och dataanalys Sekvenseringsdata för varje prov utvärderades för sekvenseringskvalitet med hjälp av en mängd olika parametrar, inklusive om sekvenseringsdata når en förinställd nivå; om Q30-värdet är acceptabelt; om CpG-stället är balanserat, om täckningen är upp till standard, om amplikonsekvenseringsdjupet är som förväntat och om sekvenseringslikformigheten är acceptabel.

De cancerspecifika DNA-metyleringssignalerna i sekvenseringsresultaten sammanfattas och analyseras enligt den modell som fastställts i våra tidigare studier. Varje signalvärde överlagras med en viss vikt för att erhålla en metyleringspoäng för varje prov. I kombination med grupperingsinformationen för varje prov utförs PCA, klustring och annan klassificeringsanalys för varje prov. Metyleringssignalerna omvandlas sedan till en riskpoäng för kolorektal cancer/adenom.

Baserat på skillnaderna i riskpoäng mellan negativ grupp och positiv grupp, beräknas sensitiviteten, specificiteten och de positiva förutsagda värdena, och den kliniska tillämpningseffektiviteten av den cancerspecifika metyleringssignalen i plasma-ctDNA utvärderas.