Diagnose af kolorektal cancer og avanceret adenom ved hjælp af kræftspecifikke methyleringssignaturer

1. Forskningsbaggrund

   1.1 Diagnose af tyktarmskræft Kolorektal kræft er en almindelig malign tumor i fordøjelseskanalen. Ifølge statistikker fra 2015 er både sygelighed og dødelighed af tyktarmskræft i Kina blandt top fem af alle kræftformer. Undersøgelser har vist, at den femårige overlevelsesrate for patienter kan nå 90%, hvis patienter diagnosticeres før spredning af tumorceller. Imidlertid er kun 40% af patienterne i øjeblikket diagnosticeret på et tidligt stadium. Derfor er behandling i den tidlige fase af sygdommen et nødvendigt middel til at klare kolorektal cancer. Den primære metode, der anvendes klinisk til diagnosticering, er koloskopi. Denne metode er nøjagtig, men begrænset af mange faktorer, såsom diarré, tarmperforation, og skal forberedes på mange måder før undersøgelsen. Patienterne skal spise flydende kost, rense tarmene mv. Andre diagnostiske metoder såsom billeddannelse, histopatologisk undersøgelse har en lav detektionsrate eller forårsager skade på organet. Derfor er det en stadig udfordrende opgave at opdage tyktarmskræft på et tidligt tidspunkt.

   1.2 Påvisning af ctDNA-methylering hos kolorektal cancerpatienter og kliniske undersøgelser Epigenetik refererer til en arvelig fænotypisk ændring uden ændring i den primære sekvens af DNA'et. DNA-methylering er en af ​​de epigenetiske modifikationsveje, som kan forårsage ændringer i kromatinstruktur og DNA-stabilitet og regulere gentransskription og -ekspression. Undersøgelser har fundet ud af, at DNA-methylering har en tæt sammenhæng med forekomsten og udviklingen af ​​tumorer. DNA-methyleringsændringer forekommer på adskillige DNA-steder i tumorceller sammenlignet med normale celler. Yderligere undersøgelser viser, at DNA-methylering forekommer tidligt i kræftforløbet, hvilket gør det muligt at anvende DNA-methylering til tidlig screening af kræft.

   Baseret på forskningspapiret udgivet af professor Kun Zhang i Nature Genetics, opfandt Singlera Genomics Inc. den proprietære methyl-Titan-sekventeringsteknologi og udviklede en detektionsmetode for kolorektal cancer og avanceret adenom (Adenoma/Colorectal cancer Early detection, ACE). ACE er en blodbaseret ikke-invasiv diagnostisk teknik. Det har høj overholdelsesgrad sammenlignet med koloskopi, og prøveudtagning er mere bekvem end afføringstestning. Det har også meget højere følsomhed sammenlignet med eksisterende blodprøvemetoder. Baseret på disse fordele er ACE-teknologien velegnet til tidlig diagnose af kolorektal cancer.

   Under udviklingsfasen brugte Singlera Genomics Inc. en screeningsmetode med høj kapacitet og høj dækning for 4 millioner CpG-methyleringssteder i genomet og analyserede forskellige stadier af kolorektal cancer, adenom, polypvævsprøver og parret normalt væv for at screene kolorektal cancer -relaterede methyleringssteder. Plasmaprøver fra cancerpatienter og raske mennesker blev også analyseret for at vælge ctDNA-methyleringsmarkører for tyktarmskræft.

   Den nuværende undersøgelse planlægger at bruge ACE-metoden til at analysere ctDNA i blodet for de cancerspecifikke DNA-methyleringsmarkører for at hjælpe med differentialdiagnosticering af patienter med kolorektal cancer og adenom. Denne teknik vil i høj grad reducere ubehaget ved diagnosticering af mistænkte patienter og forbedre diagnosen af ​​højrisikopopulationer for tyktarmskræft. Den højere detektionsrate er gavnlig for tidlig opdagelse og tidlig behandling af tyktarmskræft, hvilket effektivt vil spare medicinske omkostninger og forbedre patienternes overlevelsesrate.

2. Forskningsmål

   2.1. Primære mål At etablere et detektionssystem baseret på plasma-ctDNA-methyleringssekventeringsteknologi til hjælpediagnose af kolorektal cancer og adenom; At vurdere den diagnostiske værdi af plasma-ctDNA-methyleringssignatur for kolorektal cancer og adenom.

   2.2. Sekundære mål At vurdere sammenhængen mellem plasma-ctDNA-methyleringssignaler med koloskopiresultater og patologiske resultater af kirurgiske prøver.

3. Forskningsoversigt

   3.1 Forskningsdesign og -planlægning Denne undersøgelse var en prospektiv, åben, kontrolleret, multicenterundersøgelse. De tilmeldte prøver indeholder en positiv gruppe (inklusive kolorektal cancer stadium I-IV, fremskreden adenom) og en negativ gruppe (ikke-avanceret adenom, patienter med negativ patologisk undersøgelse, raske personer med negative koloskopiresultater, godartet hyperplasi og inflammatorisk kolorektal sygdom uden dysplasi ). Prøvestørrelserne er: 700 tilfælde positive og 600 tilfælde negative.

   3.2 Antal sager og gruppering Dette forsøg planlægger at optage 1300 forsøgspersoner, som vil blive opdelt i to grupper. Den positive gruppe omfatter 300 tilfælde af kolorektal cancer (stadium I-IV) og 400 tilfælde af fremskreden adenom (højgradig dysplasi, villøs adenom, tubulær adenom, takkede læsioner osv.). Den negative gruppe (600 tilfælde i alt) inkluderer: ikke-avancerede adenomer (størrelse ≤10 mm, ikke mindre end 100 tilfælde), inflammatorisk kolorektal sygdom, benign hyperplasi, tumorfrie patienter efter histopatologisk gennemgang og normale raske mennesker.

   3.3 Forskningsprocedure

   3.3.1 Patientscreening Forskeren vil bede hver enkelt forsøgsperson om grundlæggende information, sygdomshistorie, familiehistorie, medicinhistorie, og hvorvidt de har deltaget i relaterede kliniske forsøg for at afgøre, om de opfylder inklusionskriterierne. Baseret på deres registreringer bliver de forsøgspersoner, der opfylder inklusionskriterierne, først opdelt i en simpel positiv gruppe og en negativ gruppe. En informeret samtykkeformular vil blive underskrevet for hver tilmeldt patient.

   Alle forsøgspersoner, der fuldfører den indledende gruppering, vil få deres perifere venøse blod opsamlet, før de gennemgår koloskopi og klinisk behandling. 20 ml af blodprøven centrifugeres i henhold til kravene til ctDNA-detektionsplasmaseparation. Supernatantplasmaet opsamles og nedkøles straks.

   3.3.2 Klinisk undersøgelse Koloskopi udføres på alle emner (undtagen dem, der har kirurgiske patologiske resultater). For patienter med tarmlæsioner udføres koloskopi for at afgøre, om de er positive eller negative. Positive patienter, som har behov for kirurgisk resektion, vil blive yderligere klassificeret i henhold til deres kirurgiske histopatologiske resultater. For negative patienter bør typen af ​​læsion afklares.

   3.3.3 ACE-testning Alle plasmaprøver af de forsøgspersoner, der er tildelt specifikke grupper, transporteres til Shanghai Singlera Genomics Inc. (nr. 20, bane 500, Furonghua Road, Pudong New Area, Shanghai). cfDNA ekstraheres fra patientplasma, og cancerspecifik DNA-methyleringsprofil analyseres. I henhold til resultaterne af plasma-ctDNA-methyleringstest bedømmes risikoen for kolorektal cancer hos de indskrevne forsøgspersoner og kombineres med grupperingsinformation for at vurdere den kliniske anvendelsesværdi af den cancerspecifikke methyleringsprofil i ctDNA til tidlig cancer- og adenomdiagnose.

   3.4 Slutpunktsbestemmelse De positive forsøgspersoner bestemmes ud fra resultaterne af kirurgisk histopatologisk undersøgelse; de negative forsøgspersoner bestemmes ud fra koloskopiresultater.

   ctDNA-methyleringsprofilen analyseres for positive og negative forsøgspersoner.

4. Statistisk analyse

4.1 Prøvestørrelsesvurdering Resultaterne af denne undersøgelse er kolorektal cancer-specifikke methyleringssignaler fra perifert blod ctDNA. Methyleringssignalerne vil alle blive overlejret med en vis vægt, og den endelige score er i en enkelt talform. Vores foreløbige resultater viste, at middelværdien af ​​kontrolgruppen (μ1) var 0,36, og middelværdien af ​​testgruppen (μ2) var 0,73. Den gennemsnitlige forskel mellem grupperne var δ = μ2 - μ1= 0,37, standardafvigelsen σ af den samlede prøvestandardafvigelse s er 0,42. Indstil kontrolniveauet α til 0,005 på begge sider. Verifikationsydelsen β er 0,005, og t-værditabellen forespørges for at opnå t(α) = 2,807, t(β) = 2,576.

Følgende formel bruges til at beregne stikprøvestørrelsen:

n = 2*((tα + tβ)*S/δ)2

Det beregnede resultat er n = 74,68, som er afrundet til 75. I betragtning af, at de tilmeldte prøver kan have 25 % ubrugelige tilfælde, blev den mindste prøvestørrelse for testgruppen sat til 100 tilfælde.

Positiv gruppe 1, kolorektal cancer stadium I-IV, ingen grund til at tildele grupper i hver underkategori. I betragtning af at balancere antallet af stikprøver mellem andre grupper, er stikprøvestørrelsen sat til 300 tilfælde.

Positiv gruppe 2, fremskreden adenom, ifølge "Retningslinjer for diagnosticering og behandling af tyktarmskræft" er de fremskredne adenomer opdelt i fire kategorier. Der er ikke behov for ligelig fordeling i forskellige kategorier med et gennemsnit på 100 sager pr. kategori, i alt 400 sager.

Den negative gruppe er opdelt i tre kategorier. Ikke-avancerede adenomer skal differentieres fra positive adenomer i positiv gruppe 2 og kræver en minimumsprøvestørrelse på 100 tilfælde. Andre kategorier kræver ikke en bestemt prøvestørrelse. I betragtning af balancering med andre grupper er stikprøvestørrelsen sat til i alt 600 sager.

4.2 Statistik og dataanalyse Sekventeringsdata for hver prøve blev evalueret for sekventeringskvalitet ved hjælp af en række parametre, herunder om sekventeringsdataene når et forudindstillet niveau; om Q30-værdien er acceptabel; om CpG-stedet er afbalanceret, om dækningen er op til standard, om amplikonsekventeringsdybden er som forventet, og om sekventeringsensartetheden er acceptabel.

De cancerspecifikke DNA-methyleringssignaler i sekventeringsresultaterne er opsummeret og analyseret i henhold til modellen etableret i vores tidligere undersøgelser. Hver signalværdi overlejres med en vis vægt for at opnå en methyleringsscore for hver prøve. Kombineret med grupperingsoplysningerne for hver prøve udføres PCA, clustering og anden klassificeringsanalyse for hver prøve. Methyleringssignalerne omdannes derefter til en risikoscore for kolorektal cancer/adenom.

Baseret på forskellene i risikoscore mellem negativ gruppe og positiv gruppe, beregnes sensitiviteten, specificiteten og de positive forudsagte værdier, og den kliniske anvendelseseffektivitet af det cancerspecifikke methyleringssignal i plasma-ctDNA evalueres.