Kolorektaalisyövän ja pitkälle edenneen adenooman diagnoosi syöpäspesifisten metylaatiotunnisteiden avulla

1. Tutkimuksen tausta

   1.1 Kolorektaalisyövän diagnoosi Paksusuolen syöpä on yleinen ruoansulatuskanavan pahanlaatuinen kasvain. Vuoden 2015 tilastojen mukaan sekä sairastuvuus että kuolleisuus paksusuolensyöpään ovat Kiinassa viiden suurimman syövän joukossa. Tutkimukset ovat osoittaneet, että potilaiden viiden vuoden eloonjäämisaste voi saavuttaa 90 %, jos potilaat diagnosoidaan ennen kasvainsolujen leviämistä. Kuitenkin vain 40 % potilaista diagnosoidaan tällä hetkellä varhaisessa vaiheessa. Siksi hoito taudin varhaisessa vaiheessa on välttämätön keino selviytyä paksusuolen syövästä. Pääasiallinen kliinisesti käytetty diagnoosimenetelmä on kolonoskopia. Tämä menetelmä on tarkka, mutta sitä rajoittavat monet tekijät, kuten ripuli, suolen perforaatio, ja se on valmisteltava monin tavoin ennen tutkimusta. Potilaiden tulee syödä nestemäistä ruokavaliota, puhdistaa suolet jne. Muilla diagnostisilla menetelmillä, kuten kuvantamisella, histopatologisella tutkimuksella, on alhainen havaitsemisprosentti tai ne aiheuttavat vaurioita elimelle. Siksi paksusuolensyövän havaitseminen varhaisessa vaiheessa on edelleen haastavaa.

   1.2 CtDNA:n metylaation havaitseminen paksusuolen ja peräsuolen syöpäpotilailla ja kliiniset tutkimukset Epigenetiikka tarkoittaa perinnöllistä fenotyyppimuutosta ilman muutosta DNA:n primäärisekvenssissä. DNA:n metylaatio on yksi epigeneettisistä modifikaatioreiteistä, joka voi aiheuttaa muutoksia kromatiinin rakenteessa ja DNA:n stabiilisuudessa sekä säätelee geenien transkriptiota ja ilmentymistä. Tutkimukset ovat osoittaneet, että DNA:n metylaatiolla on läheinen yhteys kasvainten esiintymiseen ja kehittymiseen. DNA:n metylaatiomuutoksia esiintyy useissa DNA:n kohdissa kasvainsoluissa verrattuna normaaleihin soluihin. Lisätutkimukset osoittavat, että DNA-metylaatio tapahtuu varhaisessa syövän prosessissa, mikä mahdollistaa DNA-metyloinnin käytön syövän varhaisessa seulonnassa.

   Professori Kun Zhangin Nature Geneticsissä julkaiseman tutkimuspaperin perusteella Singlera Genomics Inc. keksi patentoidun metyyli-titaani-sekvensointiteknologian ja kehitti havaitsemismenetelmän paksusuolensyövän ja pitkälle edenneen adenooman (Adenoma/Colorectal cancer Early Detection, ACE) varalta. ACE on veripohjainen ei-invasiivinen diagnostinen tekniikka. Sen noudattamisaste on korkea kolonoskopiaan verrattuna, ja näytteenotto on kätevämpää kuin ulosteiden testaus. Sillä on myös paljon suurempi herkkyys verrattuna olemassa oleviin verikoemenetelmiin. Näiden etujen perusteella ACE-teknologia soveltuu varhaiseen paksusuolensyövän diagnosointiin.

   Kehitysvaiheessa Singlera Genomics Inc. käytti korkean suorituskyvyn ja laajan kattavuuden seulontamenetelmää 4 miljoonalle genomin CpG-metylaatiokohdalle ja analysoi paksu- ja peräsuolen syövän eri vaiheita, adenoomaa, polyyppikudosnäytteitä ja parillisia normaaleja kudoksia paksusuolensyövän seulomiseksi. liittyvät metylaatiokohdat. Myös syöpäpotilaiden ja terveiden ihmisten plasmanäytteitä analysoitiin ctDNA-metylaatiomarkkerien valitsemiseksi paksusuolen syöpää varten.

   Nykyisessä tutkimuksessa aiotaan käyttää ACE-menetelmää ctDNA:n analysointiin veressä syöpäspesifisten DNA-metylaatiomarkkerien varalta auttaakseen erotusdiagnoosissa potilailla, joilla on paksusuolen syöpä ja adenooma. Tämä tekniikka vähentää huomattavasti epämukavien potilaiden diagnosointia ja parantaa paksusuolensyövän korkean riskin populaation diagnosointia. Korkeampi havaitsemisaste on hyödyksi paksusuolen syövän varhaisessa havaitsemisessa ja hoidossa, mikä säästää tehokkaasti lääketieteellisiä kustannuksia ja parantaa potilaiden eloonjäämisastetta.

2. Tutkimustavoitteet

   2.1. Ensisijaiset tavoitteet Perustaa plasman ctDNA-metylaatiosekvensointiteknologiaan perustuva detektiojärjestelmä kolorektaalisyövän ja adenooman apudiagnostiikkaan; Plasman ctDNA-metylaatiotunnisteen diagnostisen arvon arvioiminen paksusuolen syövän ja adenooman osalta.

   2.2. Toissijaiset tavoitteet Arvioida plasman ctDNA-metylaatiosignaalien yhteyttä kolonoskopiatuloksiin ja kirurgisten näytteiden patologisiin tuloksiin.

3. Tutkimuksen yleiskatsaus

   3.1 Tutkimuksen suunnittelu ja suunnittelu Tämä tutkimus oli prospektiivinen, avoin, kontrolloitu, monikeskustutkimus. Ilmoitetut näytteet sisältävät positiivisen ryhmän (mukaan lukien paksusuolensyövän vaihe I-IV, pitkälle edennyt adenooma) ja negatiivisen ryhmän (ei edennyt adenooma, potilaat, joilla on negatiivinen patologinen tutkimus, terveet ihmiset, joiden kolonoskopiatulos on negatiivinen, hyvänlaatuinen hyperplasia ja tulehduksellinen paksusuolen syöpä ilman dysplasiaa ). Otoskoot ovat: 700 positiivista ja 600 negatiivista tapausta.

   3.2 Tapausten lukumäärä ja ryhmittelytapa Tässä kokeessa on tarkoitus ottaa mukaan 1300 koehenkilöä, jotka jaetaan kahteen ryhmään. Positiiviseen ryhmään kuuluu 300 kolorektaalisyövän tapausta (vaihe I-IV) ja 400 pitkälle edennyttä adenoomatapausta (korkeaasteinen dysplasia, villous adenooma, tubulaarinen adenooma, hammasleesiot jne.). Negatiivinen ryhmä (yhteensä 600 tapausta) sisältää: ei-edenneet adenoomat (koko ≤ 10 mm, vähintään 100 tapausta), tulehduksellinen paksusuolensairaus, hyvänlaatuinen hyperplasia, kasvaimettomat potilaat histopatologisen tarkastelun perusteella ja normaalit terveet ihmiset.

   3.3 Tutkimusmenettely

   3.3.1 Potilaan seulonta Tutkija pyytää jokaiselta koehenkilöltä perustietoja, sairaushistoriaa, sukuhistoriaa, lääkityshistoriaa ja sitä, onko hän osallistunut asiaan liittyviin kliinisiin tutkimuksiin, jotta voidaan määrittää, täyttävätkö he osallistumiskriteerit. Osallistumiskriteerit täyttävät koehenkilöt jaetaan tietueidensa perusteella ensin yksinkertaiseen positiiviseen ja negatiiviseen ryhmään. Jokaisesta ilmoittautuneesta potilaasta allekirjoitetaan tietoinen suostumuslomake.

   Kaikilta alkuperäisen ryhmittelyn suorittaneilta potilailta perifeerinen laskimoveri kerätään ennen kolonoskopiaa ja kliinistä hoitoa. 20 ml verinäytettä sentrifugoidaan ctDNA-detektion plasmaerotusvaatimusten mukaisesti. Supernatanttiplasma kerätään ja jäähdytetään välittömästi.

   3.3.2 Kliininen tutkimus Kolonoskopia suoritetaan kaikille koehenkilöille (paitsi niille, joilla on kirurgisen patologian tuloksia). Potilaille, joilla on suolistovaurioita, suoritetaan kolonoskopia sen määrittämiseksi, ovatko ne positiiviset vai negatiiviset. Positiiviset potilaat, jotka tarvitsevat kirurgisen resektion, luokitellaan edelleen niiden kirurgisten histopatologisten tulosten mukaan. Negatiivisten potilaiden kohdalla leesion tyyppi tulee selvittää.

   3.3.3 ACE-testaus Kaikki tiettyihin ryhmiin jaettujen koehenkilöiden plasmanäytteet kuljetetaan Shanghai Singlera Genomics Inc:lle (nro 20, Lane 500, Furonghua Road, Pudong New Area, Shanghai). cfDNA uutetaan potilaan plasmasta ja syöpäspesifinen DNA-metylaatioprofiili analysoidaan. Plasman ctDNA-metylaatiotestin tulosten mukaan tutkimukseen osallistuneiden koehenkilöiden paksusuolensyövän riski pisteytetään ja yhdistetään ryhmittelytietoihin, jotta voidaan arvioida ctDNA:n syöpäspesifisen metylaatioprofiilin kliinistä käyttöarvoa varhaisessa syövän ja adenooman diagnosoinnissa.

   3.4 Päätepisteen määritys Positiiviset kohteet määritetään kirurgisen histopatologisen tutkimuksen tulosten perusteella; negatiiviset kohteet määritetään kolonoskopian tulosten perusteella.

   ctDNA-metylaatioprofiili analysoidaan positiivisten ja negatiivisten koehenkilöiden osalta.

4. Tilastollinen analyysi

4.1 Näytteen koon arviointi Tämän tutkimuksen tulokset ovat kolorektaalisyöväspesifisiä metylaatiosignaaleja perifeerisen veren ctDNA:sta. Metylaatiosignaalit asetetaan päällekkäin tietyllä painolla, ja lopullinen pistemäärä on yksi numeromuoto. Alustavat tulokset osoittivat, että kontrolliryhmän (μ1) keskiarvo oli 0,36 ja koeryhmän (μ2) keskiarvo 0,73. Keskimääräinen ero ryhmien välillä oli δ = μ2 - μ1 = 0,37, kokonaisnäytteen keskihajonnan s keskihajonta σ on 0,42. Aseta tarkistustasoksi α 0,005 molemmille puolille. Varmennussuorituskyky β on 0,005, ja t-arvotaulukosta kysytään, jotta saadaan t(α) = 2,807, t(β) = 2,576.

Otoskoon laskemiseen käytetään seuraavaa kaavaa:

n = 2*((tα + tβ)*S/δ)2

Laskettu tulos on n = 74,68, joka pyöristetään 75:een. Ottaen huomioon, että rekisteröidyissä näytteissä voi olla 25 % käyttökelvottomia tapauksia, testiryhmän vähimmäisotoskooksi asetettiin 100 tapausta.

Positiivinen ryhmä 1, paksusuolensyövän vaihe I-IV, ryhmiä ei tarvitse jakaa kuhunkin alaluokkaan. Kun otetaan huomioon näytteiden lukumäärän tasapainottaminen muiden ryhmien välillä, otoskooksi asetetaan 300 tapausta.

Positiivinen ryhmä 2, pitkälle edennyt adenooma, "Koorektaalisyövän diagnosointia ja hoitoa koskevien ohjeiden" mukaan, pitkälle edenneet adenoomat on jaettu neljään luokkaan. Tasapuolista jakautumista eri luokkiin ei tarvita, keskimäärin 100 tapausta luokkaa kohden, yhteensä 400 tapausta.

Negatiivinen ryhmä on jaettu kolmeen luokkaan. Ei-edenneet adenoomat on erotettava positiivisista adenoomista positiivisessa ryhmässä 2, ja näytteen vähimmäiskoko on 100 tapausta. Muut luokat eivät vaadi tiettyä otoskokoa. Kun otetaan huomioon tasapainottaminen muiden ryhmien kanssa, otoskoko on asetettu yhteensä 600 tapaukseen.

4.2 Tilastot ja data-analyysi Kunkin näytteen sekvensointitiedoista arvioitiin sekvensoinnin laatu käyttämällä useita parametreja, mukaan lukien se, saavuttavatko sekvensointitiedot ennalta asetetun tason; onko Q30-arvo hyväksyttävä; onko CpG-kohta tasapainossa, onko peitto standardin mukainen, onko amplikonin sekvensointisyvyys odotettavissa ja onko sekvensoinnin tasaisuus hyväksyttävää.

Sekvensointituloksissa olevat syöpäspesifiset DNA-metylaatiosignaalit on koottu yhteen ja analysoitu aikaisemmissa tutkimuksissamme luodun mallin mukaisesti. Jokainen signaaliarvo on päällekkäin tietyllä painolla, jotta saadaan metylaatiopisteet kullekin näytteelle. Yhdessä kunkin näytteen ryhmittelytietojen kanssa jokaiselle näytteelle suoritetaan PCA-, klusterointi- ja muu luokitteluanalyysi. Metylaatiosignaalit muunnetaan sitten kolorektaalisyövän/adenooman riskipisteiksi.

Negatiivisen ja positiivisen ryhmän riskipisteiden erojen perusteella lasketaan herkkyys, spesifisyys ja positiiviset ennustetut arvot ja arvioidaan syöpäspesifisen metylaatiosignaalin kliininen sovellusteho plasman ctDNA:ssa.