Диагностика колоректального рака и запущенной аденомы с использованием сигнатур метилирования, специфичных для рака

1. Предыстория исследования

   1.1 Диагностика колоректального рака Колоректальный рак является распространенной злокачественной опухолью пищеварительного тракта. Согласно статистике за 2015 год, как заболеваемость, так и смертность от колоректального рака в Китае входят в первую пятерку всех видов рака. Исследования показали, что пятилетняя выживаемость пациентов может достигать 90%, если больным поставлен диагноз до распространения опухолевых клеток. Однако только 40% пациентов в настоящее время диагностируются на ранней стадии. Поэтому лечение на ранней стадии заболевания является необходимым средством борьбы с колоректальным раком. Основным клиническим методом диагностики является колоноскопия. Этот метод является точным, но ограничен многими факторами, такими как диарея, перфорация кишечника, и требует многосторонней подготовки перед обследованием. Больным необходимо соблюдать жидкую диету, очищать кишечник и т. д. Другие методы диагностики, такие как визуализация, гистопатологическое исследование, имеют низкую скорость обнаружения или вызывают повреждение органа. Таким образом, выявление колоректального рака на ранней стадии остается сложной задачей.

   1.2 Обнаружение метилирования цДНК у пациентов с колоректальным раком и клинические исследования Эпигенетика относится к наследственным фенотипическим изменениям без изменения первичной последовательности ДНК. Метилирование ДНК — один из путей эпигенетической модификации, который может вызывать изменения в структуре хроматина и стабильности ДНК, а также регулировать транскрипцию и экспрессию генов. Исследования показали, что метилирование ДНК тесно связано с возникновением и развитием опухолей. Изменения метилирования ДНК происходят во многих участках ДНК в опухолевых клетках по сравнению с нормальными клетками. Дальнейшие исследования показывают, что метилирование ДНК происходит на ранних стадиях развития рака, что позволяет использовать метилирование ДНК для раннего скрининга рака.

   На основе исследовательской работы, опубликованной профессором Кун Чжаном в журнале Nature Genetics, компания Singlera Genomics Inc. изобрела запатентованную технологию секвенирования метил-титана и разработала метод обнаружения колоректального рака и запущенной аденомы (раннее обнаружение аденомы/колоректального рака, ACE). ACE является неинвазивным методом диагностики на основе крови. По сравнению с колоноскопией у него более высокая степень соблюдения, а отбор проб более удобен, чем анализ кала. Он также имеет гораздо более высокую чувствительность по сравнению с существующими методами анализа крови. Основываясь на этих преимуществах, технология ACE подходит для ранней диагностики колоректального рака.

   На этапе разработки Singlera Genomics Inc. использовала метод скрининга с высокой пропускной способностью и широким охватом для 4 миллионов сайтов метилирования CpG в геноме и анализировала различные стадии колоректального рака, аденомы, образцы тканей полипов и парные нормальные ткани для скрининга колоректального рака. - связанные сайты метилирования. Образцы плазмы больных раком и здоровых людей также были проанализированы для выбора маркеров метилирования цДНК для колоректального рака.

   В текущем исследовании планируется использовать метод ACE для анализа цДНК в крови на наличие онкоспецифических маркеров метилирования ДНК, чтобы помочь в дифференциальной диагностике пациентов с колоректальным раком и аденомой. Этот метод значительно уменьшит дискомфорт при диагностике пациентов с подозрением на колоректальный рак и улучшит диагностику популяции высокого риска колоректального рака. Более высокая частота выявления способствует раннему выявлению и раннему лечению колоректального рака, что эффективно снижает медицинские расходы и повышает выживаемость пациентов.

2. Цели исследования

   2.1. Основные цели Создать систему обнаружения на основе технологии секвенирования метилирования цДНК плазмы для вспомогательной диагностики колоректального рака и аденомы; Оценить диагностическую ценность сигнатуры метилирования цДНК плазмы для колоректального рака и аденомы.

   2.2. Второстепенные цели Оценить связь сигналов метилирования цДНК плазмы с результатами колоноскопии и патологическими результатами хирургических образцов.

3. Обзор исследований

   3.1 Дизайн и планирование исследования Это исследование было проспективным, открытым, контролируемым, многоцентровым. Зарегистрированные образцы содержат положительную группу (включая колоректальный рак I-IV стадии, распространенную аденому) и отрицательную группу (нераспространенная аденома, пациенты с отрицательным патологоанатомическим исследованием, здоровые люди с отрицательными результатами колоноскопии, доброкачественной гиперплазией и воспалительным колоректальным заболеванием без дисплазии). ). Размеры выборки: 700 случаев положительных и 600 случаев отрицательных.

   3.2 Количество случаев и схема группировки В этом испытании планируется включить 1300 субъектов, которые будут разделены на две группы. Положительная группа включает 300 случаев колоректального рака (стадия I-IV) и 400 случаев запущенной аденомы (дисплазия высокой степени, ворсинчатая аденома, тубулярная аденома, зубчатые поражения и т. д.). В отрицательную группу (всего 600 случаев) входят: нераспространенные аденомы (размер ≤10 мм, не менее 100 случаев), воспалительные колоректальные заболевания, доброкачественная гиперплазия, пациенты без опухолей при гистологическом исследовании и нормальные здоровые люди.

   3.3 Процедура исследования

   3.3.1 Скрининг пациентов Исследователь запрашивает у каждого субъекта основную информацию, историю болезни, семейный анамнез, историю приема лекарств, а также информацию о том, участвовали ли они в соответствующих клинических испытаниях, чтобы определить, соответствуют ли они критериям включения. На основании своих записей субъекты, отвечающие критериям включения, сначала делятся на простую положительную группу и отрицательную группу. Форма информированного согласия будет подписана для каждого зарегистрированного пациента.

   У всех субъектов, завершивших первоначальную группировку, будет собрана периферическая венозная кровь перед прохождением колоноскопии и клинического лечения. 20 мл образца крови центрифугируют в соответствии с требованиями разделения плазмы для обнаружения цДНК. Надосадочную плазму собирают и немедленно охлаждают.

   3.3.2 Клинический осмотр Колоноскопия проводится всем обследуемым (кроме имеющих результаты хирургической патологии). Пациентам с поражениями кишечника проводят колоноскопию, чтобы определить, положительные они или отрицательные. Положительные пациенты, нуждающиеся в хирургической резекции, будут дополнительно классифицированы в соответствии с результатами хирургического гистопатологического исследования. Для отрицательных пациентов следует уточнить тип поражения.

   3.3.3 Тестирование ACE Все образцы плазмы субъектов, отнесенных к определенным группам, транспортируются в Shanghai Singlera Genomics Inc. (№ 20, Lane 500, Furonghua Road, Pudong New Area, Shanghai). вкДНК выделяют из плазмы пациента и анализируют профиль метилирования ДНК, специфичный для рака. По результатам теста на метилирование кДНК в плазме оценивается риск развития колоректального рака у включенных в исследование субъектов, и в сочетании с информацией о группировке оценивается ценность клинического применения профиля канцер-специфического метилирования в кДНК для ранней диагностики рака и аденомы.

   3.4 Определение конечной точки Положительные субъекты определяются на основании результатов хирургического гистопатологического исследования; отрицательные субъекты определяются на основании результатов колоноскопии.

   Профиль метилирования цДНК анализируют для положительных и отрицательных субъектов.

4. статистический анализ

4.1 Оценка размера выборки Результаты этого исследования представляют собой сигналы метилирования, характерные для колоректального рака, из ctDNA периферической крови. Все сигналы метилирования будут наложены друг на друга с определенным весом, и окончательная оценка будет представлена ​​в виде одного числа. Наши предварительные результаты показали, что среднее значение контрольной группы (μ1) составило 0,36, а среднее значение тестовой группы (μ2) — 0,73. Средняя разница между группами составила δ = μ2 - μ1 = 0,37, стандартное отклонение σ общего стандартного отклонения выборки s равно 0,42. Установите контрольный уровень α на 0,005 с обеих сторон. Эффективность проверки β составляет 0,005, и запрашивается таблица значений t, чтобы получить t(α) = 2,807, t(β) = 2,576.

Для расчета размера выборки используется следующая формула:

n = 2*((tα + tβ)*S/δ)2

Расчетный результат n = 74,68, что округляется до 75. Учитывая, что в зарегистрированных выборках может быть 25% непригодных для использования случаев, минимальный размер выборки тестовой группы был установлен равным 100 случаям.

Положительная группа 1, колоректальный рак I-IV стадии, нет необходимости выделять группы в каждой подкатегории. Учитывая балансировку количества выборок между другими группами, размер выборки установлен на уровне 300 случаев.

Положительная группа 2, запущенная аденома, согласно «Руководству по диагностике и лечению колоректального рака», распространенные аденомы делятся на четыре категории. Нет необходимости в равном распределении по разным категориям, в среднем по 100 дел на категорию, всего 400 дел.

Отрицательная группа делится на три категории. Незапущенные аденомы необходимо дифференцировать от положительных аденом в положительной группе 2, и требуется минимальный размер выборки 100 случаев. Другие категории не требуют определенного размера выборки. С учетом баланса с другими группами размер выборки составляет в общей сложности 600 случаев.

4.2 Статистика и анализ данных Данные секвенирования для каждого образца оценивались на предмет качества секвенирования с использованием множества параметров, включая достижение заданного уровня данных секвенирования; приемлемо ли значение Q30; сбалансирован ли сайт CpG, соответствует ли покрытие стандарту, соответствует ли ожидаемая глубина секвенирования ампликона и приемлема ли однородность секвенирования.

Сигналы метилирования ДНК, специфичные для рака, в результатах секвенирования суммируются и анализируются в соответствии с моделью, установленной в наших предыдущих исследованиях. На каждое значение сигнала накладывается определенный вес для получения оценки метилирования для каждого образца. В сочетании с информацией о группировке каждого образца для каждого образца выполняется PCA, кластеризация и другой классификационный анализ. Затем сигналы метилирования преобразуются в показатель риска колоректального рака/аденомы.

На основании различий показателей риска между отрицательной группой и положительной группой рассчитывают чувствительность, специфичность и положительные предсказанные значения, а также оценивают эффективность клинического применения сигнала канцер-специфического метилирования в цДНК плазмы.