Diagnóstico de câncer colorretal e adenoma avançado usando assinaturas de metilação específicas do câncer

1. Histórico de pesquisa

   1.1 Diagnóstico do câncer colorretal O câncer colorretal é um tumor maligno comum do trato digestivo. De acordo com estatísticas de 2015, tanto a morbidade quanto a mortalidade do câncer colorretal na China estão entre os cinco principais de todos os tipos de câncer. Estudos têm mostrado que a taxa de sobrevivência de cinco anos dos pacientes pode atingir 90% se os pacientes forem diagnosticados antes da disseminação das células tumorais. No entanto, apenas 40% dos pacientes são diagnosticados atualmente em estágio inicial. Portanto, o tratamento no estágio inicial da doença é um meio necessário para lidar com o câncer colorretal. O principal método utilizado clinicamente para o diagnóstico é a colonoscopia. Este método é preciso, mas limitado por muitos fatores, como diarreia, perfuração intestinal e precisa ser preparado de várias maneiras antes do exame. Os pacientes precisam comer uma dieta fluida, limpar os intestinos, etc. Outros métodos de diagnóstico, como exames de imagem, exame histopatológico, têm baixa taxa de detecção ou causam danos ao órgão. Portanto, ainda é uma tarefa desafiadora detectar o câncer colorretal em um estágio inicial.

   1.2 Detecção da metilação do ctDNA em pacientes com câncer colorretal e estudos clínicos A epigenética refere-se a uma alteração fenotípica hereditária sem alteração na sequência primária do DNA. A metilação do DNA é uma das vias de modificação epigenética, que pode causar alterações na estrutura da cromatina e na estabilidade do DNA, além de regular a transcrição e a expressão gênica. Estudos descobriram que a metilação do DNA tem uma relação estreita com a ocorrência e desenvolvimento de tumores. Alterações na metilação do DNA ocorrem em vários locais do DNA nas células tumorais em comparação com as células normais. Estudos posteriores mostram que a metilação do DNA ocorre no início do processo de câncer, tornando possível usar a metilação do DNA para a triagem precoce do câncer.

   Com base no trabalho de pesquisa publicado pelo professor Kun Zhang na Nature Genetics, a Singlera Genomics Inc. inventou a tecnologia proprietária de sequenciamento de metil-Titan e desenvolveu um método de detecção para câncer colorretal e adenoma avançado (detecção precoce de adenoma/câncer colorretal, ACE). A ACE é uma técnica de diagnóstico não invasiva baseada no sangue. Tem alta taxa de adesão em comparação com a colonoscopia, e a amostragem é mais conveniente do que o teste de fezes. Ele também tem uma sensibilidade muito maior em comparação com os métodos de teste de sangue existentes. Com base nessas vantagens, a tecnologia ACE é adequada para o diagnóstico precoce do câncer colorretal.

   Durante o estágio de desenvolvimento, a Singlera Genomics Inc. usou um método de triagem de alto rendimento e alta cobertura para 4 milhões de locais de metilação CpG no genoma e analisou diferentes estágios de câncer colorretal, adenoma, amostras de tecido de pólipos e tecidos normais pareados para rastrear o câncer colorretal locais de metilação relacionados. Amostras de plasma de pacientes com câncer e pessoas saudáveis ​​também foram analisadas para selecionar marcadores de metilação do ctDNA para câncer colorretal.

   O estudo atual planeja usar o método ACE para analisar o ctDNA no sangue para os marcadores de metilação do DNA específicos do câncer para auxiliar no diagnóstico diferencial de pacientes com câncer colorretal e adenoma. Essa técnica reduzirá muito o desconforto no diagnóstico de pacientes suspeitos e melhorará o diagnóstico da população de alto risco de câncer colorretal. A taxa de detecção mais alta é benéfica para a detecção precoce e o tratamento precoce do câncer colorretal, o que efetivamente economizará custos médicos e melhorará a taxa de sobrevivência dos pacientes.

2. Objetivos de pesquisa

   2.1. Objetivos principais Estabelecer um sistema de detecção baseado na tecnologia de sequenciamento de metilação do ctDNA plasmático para o diagnóstico auxiliar de câncer colorretal e adenoma; Avaliar o valor diagnóstico da assinatura plasmática de metilação do ctDNA para câncer colorretal e adenoma.

   2.2. Objetivos secundários Avaliar a associação dos sinais plasmáticos de metilação do ctDNA com os resultados da colonoscopia e os resultados patológicos das peças cirúrgicas.

3. Visão geral da pesquisa

   3.1 Desenho e planejamento da pesquisa Este estudo foi prospectivo, aberto, controlado e multicêntrico. As amostras inscritas contêm um grupo positivo (incluindo câncer colorretal estágio I-IV, adenoma avançado) e um grupo negativo (adenoma não avançado, pacientes com exame patológico negativo, pessoas saudáveis ​​com resultados negativos de colonoscopia, hiperplasia benigna e doença inflamatória colorretal sem displasia ). Os tamanhos amostrais são: 700 casos positivos e 600 casos negativos.

   3.2 Número de casos e esquema de agrupamento Este estudo planeja inscrever 1.300 indivíduos, que serão divididos em dois grupos. O grupo positivo inclui 300 casos de câncer colorretal (estágio I-IV) e 400 casos de adenoma avançado (displasia de alto grau, adenoma viloso, adenoma tubular, lesões serrilhadas, etc.). O grupo negativo (600 casos no total) inclui: adenomas não avançados (tamanho≤10mm, não menos que 100 casos), doença colorretal inflamatória, hiperplasia benigna, pacientes sem tumor na revisão histopatológica e pessoas saudáveis ​​normais.

   3.3 Procedimento de pesquisa

   3.3.1 Triagem do paciente O pesquisador solicitará a cada participante informações básicas, histórico de doenças, histórico familiar, histórico de medicamentos e se eles participaram ou não de ensaios clínicos relacionados para determinar se atendem aos critérios de inclusão. Com base em seus registros, os sujeitos que atendem aos critérios de inclusão são primeiro divididos em um grupo positivo simples e um grupo negativo. Um formulário de consentimento informado será assinado para cada paciente inscrito.

   Todos os indivíduos que concluírem o agrupamento inicial terão seu sangue venoso periférico coletado antes de serem submetidos à colonoscopia e tratamento clínico. 20 ml da amostra de sangue são centrifugados de acordo com os requisitos de separação de plasma de detecção de ctDNA. O plasma sobrenadante é coletado e imediatamente refrigerado.

   3.3.2 Exame clínico A colonoscopia é realizada em todos os indivíduos (exceto aqueles com resultados de patologia cirúrgica). Para pacientes com lesões intestinais, a colonoscopia é realizada para determinar se são positivas ou negativas. Os pacientes positivos que necessitam de ressecção cirúrgica serão posteriormente classificados de acordo com seus resultados histopatológicos cirúrgicos. Para pacientes negativos, o tipo de lesão deve ser esclarecido.

   3.3.3 Teste de ACE Todas as amostras de plasma dos indivíduos designados para grupos específicos são transportadas para Shanghai Singlera Genomics Inc. (No. 20, Lane 500, Furonghua Road, Pudong New Area, Shanghai). O cfDNA é extraído do plasma do paciente e o perfil de metilação do DNA específico do câncer é analisado. De acordo com os resultados do teste de metilação do ctDNA no plasma, o risco de câncer colorretal dos indivíduos inscritos é pontuado e combinado com informações de agrupamento para avaliar o valor da aplicação clínica do perfil de metilação específico do câncer no ctDNA para diagnóstico precoce de câncer e adenoma.

   3.4 Determinação do ponto final Os indivíduos positivos são determinados com base nos resultados do exame histopatológico cirúrgico; os indivíduos negativos são determinados com base nos resultados da colonoscopia.

   O perfil de metilação do ctDNA é analisado para indivíduos positivos e negativos.

4. Análise estatística

4.1 Estimativa do tamanho da amostra Os resultados deste estudo são sinais de metilação específicos do câncer colorretal do ctDNA do sangue periférico. Os sinais de metilação serão todos sobrepostos com um certo peso, e a pontuação final será na forma de um único número. Nossos resultados preliminares mostraram que o valor médio do grupo controle (μ1) foi 0,36, e o valor médio do grupo teste (μ2) foi 0,73. A diferença média entre os grupos foi δ = μ2 - μ1= 0,37, o desvio padrão σ do desvio padrão global da amostra s é 0,42. Defina o nível de verificação α para 0,005 em ambos os lados. O desempenho de verificação β é 0,005 e a tabela de valores t é consultada para obter t(α) = 2,807, t(β) = 2,576.

A seguinte fórmula é usada para calcular o tamanho da amostra:

n = 2*((tα + tβ)*S/δ)2

O resultado calculado é n = 74,68, que é arredondado para 75. Considerando que as amostras cadastradas podem ter 25% de casos inutilizáveis, o tamanho mínimo da amostra do grupo de teste foi definido para 100 casos.

Grupo positivo 1, câncer colorretal estágio I-IV, sem necessidade de alocar grupos em cada subcategoria. Considerando equilibrar o número de amostras entre outros grupos, o tamanho da amostra é definido para 300 casos.

Grupo positivo 2, adenoma avançado, de acordo com as "Diretrizes para o diagnóstico e tratamento do câncer colorretal", os adenomas avançados são divididos em quatro categorias. Não há necessidade de distribuição igualitária em diferentes categorias, com média de 100 casos por categoria, totalizando 400 casos.

O grupo negativo é dividido em três categorias. Os adenomas não avançados precisam ser diferenciados dos adenomas positivos no grupo positivo 2 e precisam de um tamanho amostral mínimo de 100 casos. Outras categorias não requerem um tamanho de amostra específico. Considerando o balanceamento com outros grupos, o tamanho da amostra é definido para um total de 600 casos.

4.2 Estatística e análise de dados Os dados de sequenciamento para cada amostra foram avaliados quanto à qualidade do sequenciamento usando uma variedade de parâmetros, incluindo se os dados de sequenciamento atingem um nível predefinido; se o valor Q30 é aceitável; se o local CpG está equilibrado, se a cobertura está de acordo com o padrão, se a profundidade de sequenciamento do amplicon é a esperada e se a uniformidade de sequenciamento é aceitável.

Os sinais de metilação do DNA específicos do câncer nos resultados do sequenciamento são resumidos e analisados ​​de acordo com o modelo estabelecido em nossos estudos anteriores. Cada valor de sinal é sobreposto com um determinado peso para obter uma pontuação de metilação para cada amostra. Combinado com as informações de agrupamento de cada amostra, PCA, agrupamento e outras análises de classificação são realizadas para cada amostra. Os sinais de metilação são então convertidos em uma pontuação de risco de câncer colorretal/adenoma.

Com base nas diferenças das pontuações de risco entre o grupo negativo e o grupo positivo, a sensibilidade, a especificidade e os valores positivos previstos são calculados e a eficácia da aplicação clínica do sinal de metilação específico do câncer no ctDNA plasmático é avaliada.