Diagnose von Darmkrebs und fortgeschrittenem Adenom unter Verwendung krebsspezifischer Methylierungssignaturen

1. Forschungshintergrund

   1.1 Diagnose von Darmkrebs Darmkrebs ist ein häufiger bösartiger Tumor des Verdauungstraktes. Laut Statistiken aus dem Jahr 2015 gehören sowohl die Morbidität als auch die Mortalität von Darmkrebs in China zu den Top 5 aller Krebsarten. Studien haben gezeigt, dass die Fünf-Jahres-Überlebensrate von Patienten 90 % erreichen kann, wenn die Patienten diagnostiziert werden, bevor sich Tumorzellen ausbreiten. Derzeit werden jedoch nur 40 % der Patienten in einem frühen Stadium diagnostiziert. Daher ist eine Behandlung im Frühstadium der Erkrankung ein notwendiges Mittel, um mit Darmkrebs fertig zu werden. Die Hauptmethode, die klinisch zur Diagnose verwendet wird, ist die Koloskopie. Diese Methode ist genau, aber durch viele Faktoren begrenzt, wie z. B. Durchfall, Darmperforation, und muss vor der Untersuchung in vielerlei Hinsicht vorbereitet werden. Die Patienten müssen sich flüssig ernähren, den Darm reinigen usw. Andere diagnostische Methoden wie Bildgebung, histopathologische Untersuchung haben eine geringe Erkennungsrate oder schädigen das Organ. Daher ist es nach wie vor eine Herausforderung, Darmkrebs in einem frühen Stadium zu erkennen.

   1.2 Nachweis der ctDNA-Methylierung bei Darmkrebspatienten und klinische Studien Unter Epigenetik versteht man eine vererbbare phänotypische Veränderung ohne Veränderung der Primärsequenz der DNA. DNA-Methylierung ist einer der epigenetischen Modifikationswege, der Veränderungen in der Chromatinstruktur und DNA-Stabilität verursachen und die Gentranskription und -expression regulieren kann. Studien haben ergeben, dass die DNA-Methylierung in engem Zusammenhang mit dem Auftreten und der Entwicklung von Tumoren steht. DNA-Methylierungsänderungen treten an zahlreichen DNA-Stellen in Tumorzellen im Vergleich zu normalen Zellen auf. Weitere Studien zeigen, dass die DNA-Methylierung früh im Krebsprozess auftritt, was es möglich macht, die DNA-Methylierung für die Früherkennung von Krebs zu verwenden.

   Basierend auf der von Professor Kun Zhang in Nature Genetics veröffentlichten Forschungsarbeit erfand Singlera Genomics Inc. die proprietäre Methyl-Titan-Sequenzierungstechnologie und entwickelte eine Nachweismethode für Darmkrebs und fortgeschrittenes Adenom (Adenoma/Colorectal Cancer Early Detection, ACE). ACE ist ein blutbasiertes, nicht-invasives Diagnoseverfahren. Es hat eine hohe Compliance-Rate im Vergleich zur Koloskopie, und die Probenahme ist bequemer als die Stuhluntersuchung. Es hat auch eine viel höhere Empfindlichkeit im Vergleich zu bestehenden Bluttestmethoden. Aufgrund dieser Vorteile eignet sich die ACE-Technologie für die Früherkennung von Darmkrebs.

   Während der Entwicklungsphase verwendete Singlera Genomics Inc. eine Screening-Methode mit hohem Durchsatz und hoher Abdeckung für 4 Millionen CpG-Methylierungsstellen im Genom und analysierte verschiedene Stadien von Darmkrebs, Adenomen, Polypengewebeproben und gepaarten normalen Geweben, um Darmkrebs zu screenen -verwandte Methylierungsstellen. Plasmaproben von Krebspatienten und gesunden Menschen wurden ebenfalls analysiert, um ctDNA-Methylierungsmarker für Darmkrebs auszuwählen.

   Die aktuelle Studie plant, die ACE-Methode zur Analyse von ctDNA im Blut auf krebsspezifische DNA-Methylierungsmarker einzusetzen, um die Differenzialdiagnose von Patienten mit Darmkrebs und Adenomen zu unterstützen. Diese Technik wird die Unannehmlichkeiten bei der Diagnose von Verdachtspatienten erheblich reduzieren und die Diagnose von Dickdarmkrebs-Risikogruppen verbessern. Die höhere Erkennungsrate ist vorteilhaft für die Früherkennung und Frühbehandlung von Darmkrebs, wodurch medizinische Kosten effektiv eingespart und die Überlebensrate der Patienten verbessert werden.

2. Forschungsziele

   2.1. Primäre Ziele Etablierung eines Nachweissystems basierend auf Plasma-ctDNA-Methylierungssequenzierungstechnologie für die Hilfsdiagnose von Darmkrebs und Adenomen; Bewertung des diagnostischen Werts der Plasma-ctDNA-Methylierungssignatur für kolorektales Karzinom und Adenom.

   2.2. Sekundäre Ziele Bewertung der Assoziation von Plasma-ctDNA-Methylierungssignalen mit Koloskopieergebnissen und pathologischen Ergebnissen von chirurgischen Proben.

3. Überblick über die Forschung

   3.1 Forschungsdesign und -planung Diese Studie war eine prospektive, offene, kontrollierte, multizentrische Studie. Die aufgenommenen Proben enthalten eine positive Gruppe (einschließlich Darmkrebs Stadium I-IV, fortgeschrittenes Adenom) und eine negative Gruppe (nicht fortgeschrittenes Adenom, Patienten mit negativer pathologischer Untersuchung, Gesunde mit negativem Koloskopieergebnis, gutartige Hyperplasie und entzündliche Darmerkrankung ohne Dysplasie ). Die Stichprobenumfänge sind: 700 Fälle positiv und 600 Fälle negativ.

   3.2 Anzahl der Fälle und Gruppierungsschema In diese Studie sollen 1300 Probanden aufgenommen werden, die in zwei Gruppen eingeteilt werden. Die positive Gruppe umfasst 300 Fälle von Darmkrebs (Stadium I-IV) und 400 Fälle von fortgeschrittenem Adenom (hochgradige Dysplasie, villöses Adenom, tubuläres Adenom, gezackte Läsionen usw.). Die negative Gruppe (insgesamt 600 Fälle) umfasst: nicht fortgeschrittene Adenome (Größe ≤ 10 mm, nicht weniger als 100 Fälle), entzündliche kolorektale Erkrankung, gutartige Hyperplasie, tumorfreie Patienten nach histopathologischer Untersuchung und normale gesunde Menschen.

   3.3 Rechercheverfahren

   3.3.1 Patienten-Screening Der Forscher fragt jeden Probanden nach grundlegenden Informationen, Krankheitsgeschichte, Familienanamnese, Medikationsgeschichte und ob sie an verwandten klinischen Studien teilgenommen haben oder nicht, um festzustellen, ob sie die Einschlusskriterien erfüllen. Die Probanden, die die Einschlusskriterien erfüllen, werden anhand ihrer Aufzeichnungen zunächst in eine einfache Positivgruppe und eine Negativgruppe eingeteilt. Für jeden aufgenommenen Patienten wird eine Einverständniserklärung unterzeichnet.

   Allen Probanden, die die anfängliche Gruppierung vervollständigen, wird ihr peripheres venöses Blut entnommen, bevor sie sich einer Koloskopie und einem klinischen Management unterziehen. 20 ml der Blutprobe werden gemäß den Anforderungen an die ctDNA-Nachweisplasmatrennung zentrifugiert. Das überstehende Plasma wird gesammelt und sofort gekühlt.

   3.3.2 Klinische Untersuchung Die Koloskopie wird bei allen Probanden durchgeführt (außer denen mit chirurgischen pathologischen Ergebnissen). Bei Patienten mit Darmläsionen wird eine Koloskopie durchgeführt, um festzustellen, ob sie positiv oder negativ sind. Positive Patienten, die eine chirurgische Resektion benötigen, werden gemäß ihren chirurgischen histopathologischen Ergebnissen weiter klassifiziert. Bei negativen Patienten sollte die Art der Läsion abgeklärt werden.

   3.3.3 ACE-Test Alle Plasmaproben der bestimmten Gruppen zugeordneten Probanden werden zu Shanghai Singlera Genomics Inc. (Nr. 20, Lane 500, Furonghua Road, Pudong New Area, Shanghai) transportiert. cfDNA wird aus Patientenplasma extrahiert und das krebsspezifische DNA-Methylierungsprofil wird analysiert. Gemäß den Ergebnissen des Plasma-ctDNA-Methylierungstests wird das Darmkrebsrisiko der aufgenommenen Probanden bewertet und mit Gruppierungsinformationen kombiniert, um den klinischen Anwendungswert des krebsspezifischen Methylierungsprofils in ctDNA für die Früherkennung von Krebs und Adenomen zu bewerten.

   3.4 Endpunktbestimmung Die positiven Probanden werden auf der Grundlage der Ergebnisse der chirurgischen histopathologischen Untersuchung bestimmt; die negativen Probanden werden auf der Grundlage der Ergebnisse der Koloskopie bestimmt.

   Das ctDNA-Methylierungsprofil wird für positive und negative Probanden analysiert.

4. statistische Analyse

4.1 Schätzung der Stichprobengröße Die Ergebnisse dieser Studie sind kolorektalkrebsspezifische Methylierungssignale aus peripherer Blut-ctDNA. Die Methylierungssignale werden alle mit einem bestimmten Gewicht überlagert, und die endgültige Punktzahl liegt in Form einer einzelnen Zahl vor. Unsere vorläufigen Ergebnisse zeigten, dass der Mittelwert der Kontrollgruppe (μ1) 0,36 und der Mittelwert der Testgruppe (μ2) 0,73 betrug. Die mittlere Differenz zwischen den Gruppen betrug δ = μ2 – μ1= 0,37, die Standardabweichung σ der Standardabweichung der Gesamtstichprobe s beträgt 0,42. Stellen Sie den Prüfpegel α auf beiden Seiten auf 0,005 ein. Die Verifizierungsleistung β ist 0,005, und die t-Werttabelle wird abgefragt, um t(α) = 2,807, t(β) = 2,576 zu erhalten.

Zur Berechnung des Stichprobenumfangs wird folgende Formel verwendet:

n = 2*((tα + tβ)*S/δ)2

Das berechnete Ergebnis ist n = 74,68, was auf 75 gerundet wird. In Anbetracht der Tatsache, dass die aufgenommenen Stichproben 25 % unbrauchbare Fälle aufweisen können, wurde die Mindeststichprobengröße der Testgruppe auf 100 Fälle festgelegt.

Positive Gruppe 1, Darmkrebs Stadium I-IV, keine Notwendigkeit, Gruppen in jeder Unterkategorie zuzuordnen. In Anbetracht der Verteilung der Stichprobenanzahl auf andere Gruppen wird die Stichprobengröße auf 300 Fälle festgelegt.

Positivgruppe 2, fortgeschrittenes Adenom, nach den „Leitlinien zur Diagnostik und Therapie des Darmkrebses“ werden die fortgeschrittenen Adenome in vier Kategorien eingeteilt. Eine gleichmäßige Verteilung auf verschiedene Kategorien mit durchschnittlich 100 Fällen pro Kategorie bei insgesamt 400 Fällen ist nicht erforderlich.

Die negative Gruppe wird in drei Kategorien eingeteilt. Nicht fortgeschrittene Adenome müssen von positiven Adenomen in positiver Gruppe 2 unterschieden werden und erfordern eine Mindeststichprobengröße von 100 Fällen. Andere Kategorien erfordern keine bestimmte Stichprobengröße. Unter Berücksichtigung der Abwägung mit anderen Gruppen wird die Stichprobengröße auf insgesamt 600 Fälle festgelegt.

4.2 Statistik und Datenanalyse Die Sequenzierungsdaten für jede Probe wurden hinsichtlich der Sequenzierungsqualität unter Verwendung einer Vielzahl von Parametern bewertet, einschließlich, ob die Sequenzierungsdaten ein voreingestelltes Niveau erreichen; ob der Q30-Wert akzeptabel ist; ob die CpG-Site ausgeglichen ist, ob die Abdeckung dem Standard entspricht, ob die Amplikon-Sequenzierungstiefe wie erwartet ist und ob die Sequenzierungseinheitlichkeit akzeptabel ist.

Die krebsspezifischen DNA-Methylierungssignale in den Sequenzierungsergebnissen werden zusammengefasst und gemäß dem in unseren früheren Studien etablierten Modell analysiert. Jeder Signalwert wird mit einem bestimmten Gewicht überlagert, um einen Methylierungs-Score für jede Probe zu erhalten. Kombiniert mit den Gruppierungsinformationen jeder Probe werden PCA, Clustering und andere Klassifikationsanalysen für jede Probe durchgeführt. Die Methylierungssignale werden dann in einen Darmkrebs-/Adenom-Risiko-Score umgewandelt.

Basierend auf den Unterschieden der Risiko-Scores zwischen negativer Gruppe und positiver Gruppe werden die Sensitivität, Spezifität und positive vorhergesagte Werte berechnet und die Wirksamkeit der klinischen Anwendung des krebsspezifischen Methylierungssignals in Plasma-ctDNA wird bewertet.