心血管機能に対する遠隔虚血性コンディショニングの急性および慢性の影響

本研究は、アティコン大学病院の第 2 大学心臓病学科で実施された前向きランダム化試験です。 初回 PCI 後 48 時間以内の 270 人の STEMI 患者が、2 つのリモート コンディショニング (RIC) プロトコルに無作為に割り付けられるか、標準治療以外の介入は行われません (対照群)。 最初のプロトコルは、ベースラインの血管機能評価 (T0) の後、15 分間隔で 200 mmHg で両腕の上腕カフを 5 分間膨張させることにより、2 つの虚血刺激を利用します。 各虚血性刺激の後に血管機能評価 (T1、T2) が続き、2 回目のカフ収縮 (T3) の 25 分後に最終評価が行われます。 2 番目のプロトコルは、2 番目の虚血性刺激の省略を除いて、最初と同じです。 両方のプロトコルは、通常の上腕位置の周りに配置した後、カフの膨張を省略して、偽のコンディショニング手順が先行します。 RIC プロトコルは、30 人の健康なボランティアでも実施されます。 血液サンプルは、ベースライン (T0) と各プロトコルの終了時 (T3) に採取されます。 -すべての患者は洞調律ですが、除外基準には、インデックスイベント中のキリップクラス> 2、硝酸塩の投与、以前の既知の冠動脈または他の心血管疾患の病歴、以前のPCIまたは冠動脈バイパス手術（CABG）、および慢性炎症が含まれますそして全身性疾患。 さらに、研究者は、a)心エコー検査による左心室収縮終期容積(LVESV)の推定による左心室収縮性の変化、b)内皮グリコカリックスおよび動脈硬化の変化を評価するために、2年間の追跡調査を行う予定です。

動脈硬化は、動脈眼圧計（Complior、Alam Medical、Vincennes、France）を使用して頸動脈大腿脈波速度（PWV）によって評価されます。正常値 <10 m/s。 PWV は、頸動脈と大腿動脈の脈の触診部位の間の距離を、波間の通過時間 (m/s) で割った値として計算されます。 すべての測定は、悪用される虚血プロトコルを知らない同じ検査官によって行われます (観察者内変動 = 5%)。

舌下動脈微小血管系 (5 から 25 μm の直径範囲) の灌流境界領域 (PBR) は、Sidestream Darkfield イメージング (Microscan、Glycocheck、Microvascular Health Solutions Inc.、Salt Lake City、UT、USA) を使用して測定されます。 PBR は細胞の少ない層であり、流れる赤血球 (RBC) と微小血管内腔表面上の血漿との間の相分離から生じます。 PBR には、細胞透過を可能にするグリコカリックスの成分が含まれています。 したがって、灌流境界領域（PBR）の増加は、糖衣への赤血球のより深い浸透と一致しており、糖衣バリア特性の損失を示しており、糖衣の厚さの減少のマーカーです。 これは、動脈グリコカリックスを評価する標準化された再現性のあるオペレーターに依存しない方法を構成し、したがって内皮の完全性評価の手段として提案されています。

マロンジアルデヒド (MDA) は、市販のキット (Oxford Biomedical Research、ミシガン州ロチェスター ヒルズ、脂質過酸化の比色アッセイ、測定範囲 1 ～ 20 nmol/L、アッセイ内変動およびアッセイ間変動がそれぞれ 3.39% および 4.75%) を用いて分光光度法で測定されます。 ）。 IL-6 は、0.094 という低い値を検出する高感度イムノアッセイ [ヒト IL-6 カンチキニン (高感度)] によって測定されます (アッセイ内変動 < 5%)。

マイクロ RNA (Mirs) は、細胞または環境刺激に応答して転写後の遺伝子発現を調節する 19 ～ 25 ヌクレオチドを含む小さな一本鎖の非コード RNA 分子です [38]。 血清中での非侵襲性と安定性により、アーカイブされた血清サンプルを使用して発現を迅速に推定できます。 特定の MiRs は、心血管疾患と IRI の病因に関与しています。 MiR-144 は極めて重要な RIC メディエーターとして機能し、miR-150 と miR-499 は心筋 IRI の動物モデルの設定でアポトーシスと線維症を阻害します [40、41]。 さらに、miR-21 は、ラットの IRI 後の梗塞サイズと初期の左心室 (LV) リモデリングを減少させることが実証されています。 それどころか、miR-208 は、肥大および有害なリモデリング誘導によって有害な影響を及ぼします 。 NucleoSpin miRNA Plasma Kit (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Duren, Germany) を製造元の指示に従って使用して、サンプルから血清 miRNA を取得します。 テストされた miRNA とハウスキーピング遺伝子 U6sn の発現パターンは、逆転写とリアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) を使用して定量的に分析されました。 ステムループ相補的 DNA (cDNA) は、各 miRNA に特異的なループ逆転写プライマーを使用して合成されます。 Roche Light Cycler Fluorescence Quantitative PCR System (ABI、米国) を使用して、メーカーの指示に従って、Mir-X™ MicroRNA Quantification Kit (Clontech Laboratories、米国) で逆転写と定量化を行います。 すべてのサンプルを 3 回増幅し、再現性を確認するために各実験を 3 回繰り返しました。 発現レベルの倍率変化は、2-ΔΔCt メソッドを使用して計算されます。 PCR 用のプライマーは次のとおりです。

名前 配列 miR-150 F: 5'-TCTCCCAACCCTTGTACCAGT- 3' R: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3' miR-208 F: 5'-CTTTTGGCCCGGGTTATAC-3' R: 5'-CTGACATCCTCTAGGCTGG-3' miR-144 F: 5 '-GGGGGTACAGTATAGATGAT-3' R: 5'-TGCGTGTCGTGGAGTC-3' miR-499 F: 5'-CAAAGTCTTCACTTCCCTGCCA-3' R: 5'-GATGTTTAACTCCTCTCCACGTGATC-3' miR-21 F: 5'-CCCGCCTAGCTTATCAGACTG-3' R: 5'-GCCGTCGGTGTCAACATCA-3' miR-145 F: 5'-GGCGTCCAGTTTTCCCAG-3' R: 5'-CAGTGCTGGGTCCGAGTGA-3' U6sn F: 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3' R: 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3' NO 代謝の不活性な副産物である硝酸塩 (NO¬3-) および亜硝酸塩 (NO2-) は、古典的な L-アルギニン-NO-シンターゼとは無関係に、NO 再生の過程で再利用基質として機能することが最近示されました。 (NOS) 経路。 後者のカスケードは低酸素環境で徐々に非活性化されるため、これは心筋虚血の設定において特に重要です。 したがって、硝酸亜硝酸塩 (NOx) プールは、低酸素圧の状態で NOS を補完する NO 生物活性の貯蔵庫として認識されるべきです。 血漿中の硝酸塩/亜硝酸塩の濃度は、以前に説明したように、市販のキット (ケイマンの硝酸塩/亜硝酸塩比色アッセイ キット 780001) を使用してグリース反応を使用して決定されます。 各血漿サンプルは、10kDa の分子量カットオフ フィルター (Pall Nanosep® 遠心分離装置、オメガ メンブレン、Sigma Aldrich: Z722065) で限外濾過されます。 フィルターは、血漿の限外濾過の前に超純水で事前にすすがれます。 次に、500μL の血漿を 14.000xg、4℃で 30 分間遠心分離します。 40μLの濾液を硝酸塩/亜硝酸塩の測定に使用し、Griess試薬を添加し、リーダーInfinite 200 PROシリーズ(Tecan)を使用して各ウェルの吸光度を540nmで測定しました。 硝酸塩/亜硝酸塩の濃度は、Graph Pad プリズム バージョン 7 (Graph Pad Software, Inc.) を製造元の指示に従って使用して、それぞれ硝酸塩/亜硝酸塩標準曲線で決定されます。 結果は μmol/L で表されます。

さらに、研究者は、左心室機能が研究の 3 つのアーム (2 つの RIC プロトコルと介入なし) 間で異なるかどうかを調査するために、採用後 1 年と 2 年に心エコー検査を実施する予定です。

データの分析には、STATA v.11 と SPSS v.22 が使用されます。 Shapiro-Wilk 検定はデータが正規分布しているかどうかを調べるために使用され、Levene 検定はデータの等分散性を調べるために使用されます。 すべてのノンパラメトリック変数は、ベースライン値と介入後の値を比較するための Wilcoxon 検定を使用して比較され、多変量解析のランクに変換されます。 すべての分析で、研究者は、p<0.05 の両側検定を使用します。 研究者は、パラメトリック (ピアソン r) およびノンパラメトリック (スピアマン rho) 相関係数を使用して、横断的な関連性を調べます。 臨床および生物学的データの分散分析 (ANOVA) は、グループ間の違いをテストするために実行され、すべてのノンパラメトリック変数は、以前に公開された方法論を使用して分析に入る前にランクに変換されます。 反復測定の ANOVA (一般線形モデル、SPSS 22、SPSS Inc、シカゴ、イリノイ州) は、(a) 検査された血管機能および生化学的マーカーの測定 (前者については T0、T1、T2、および T3、ベースラインで) に適用されます。被験者内要因として使用される時間のパラメーターを使用して、後者のプロトコルの終了)、および (b) 年齢を含むモデルを使用して、2 つの RIPost プロトコル (シングルインフレーションとダブルインフレーション) および偽の手順の違いをテストします。性別、BMI、脂質異常症、糖尿病、高血圧、併用療法、心筋梗塞の位置、心筋酵素、および共変量としての冠動脈疾患 (> 70% 狭窄) の数。 研究グループとモデルに含まれる共変量との間の相互作用も調べられ、検査されたマーカーの測定時間と研究グループとの間の相互作用の F 値と p 値も計算されます。 Greenhouse-Geisser 補正は、Mauchly の検定によって評価された球形性の仮定が満たされない場合に使用されます。 事後比較は、ボンフェローニ補正で実行されます。 <0.05 の p 値は、統計的に有意であると見なされます。 血管および生化学的マーカーの観察者間および観察者内変動 (%) は、1 回目と 2 回目の測定値の差の SD として計算され、30 人の健康なボランティアの平均値のパーセンテージとして表されます。