Die akuten und chronischen Auswirkungen einer ischämischen Fernkonditionierung auf die kardiovaskuläre Funktion

Die vorliegende Studie ist eine prospektive, randomisierte Studie, die an der Zweiten Universitätsklinik für Kardiologie des Universitätsspitals Attikon durchgeführt wurde. Zweihundertsiebzig Patienten mit STEMI werden innerhalb von 48 Stunden nach der primären PCI randomisiert in zwei Fernkonditionierungsprotokolle (RIC) oder keine andere Intervention als die Standardbehandlung (Kontrollgruppe) eingeteilt. Das erste Protokoll verwendet zwei ischämische Stimuli durch Aufblasen der Brachialmanschette beider Arme bei 200 mmHg für 5 Minuten, getrennt durch 15 Minuten, nach einer Grundlinienbewertung der Gefäßfunktion (T0). Auf jeden ischämischen Stimulus folgt eine Beurteilung der Gefäßfunktion (T1, T2), mit einer abschließenden Beurteilung 25 Minuten nach dem zweiten Ablassen der Manschette (T3). Das zweite Protokoll ist identisch mit dem ersten, außer dass der zweite ischämische Stimulus weggelassen wurde. Beiden Protokollen geht ein Scheinkonditionierungsverfahren voraus, indem das Aufblasen der Manschette nach ihrer Platzierung um die normale Brachialposition weggelassen wird. Das RIC-Protokoll wird auch bei 30 gesunden Freiwilligen durchgeführt. Blutproben werden zu Beginn (T0) und am Ende jedes Protokolls (T3) entnommen. Alle Patienten befinden sich im Sinusrhythmus, während die Ausschlusskriterien Killip-Klasse > 2 während des Indexereignisses, die Verabreichung von Nitraten, die Anamnese einer früheren bekannten Koronararterien- oder anderen kardiovaskulären Erkrankung, eine frühere PCI oder Koronararterien-Bypass-Operation (CABG) sowie eine chronische Entzündung beinhalten und systemische Erkrankungen. Darüber hinaus werden die Forscher eine zweijährige Nachuntersuchung durchführen, um a) Änderungen der linksventrikulären Kontraktilität durch Schätzung des linksventrikulären endsystolischen Volumens (LVESV) durch Echokardiographiestudie b) Änderungen der endothelialen Glykokalyx und der arteriellen Steifheit zu beurteilen.

Die Arteriensteifigkeit wird anhand der Karotis-femoralen Pulswellengeschwindigkeit (PWV) unter Verwendung arterieller Tonometrie (Complior, Alam Medical, Vincennes, Frankreich) beurteilt; Normalwerte <10 m/s. PWV wird als Abstand zwischen der Karotis- und Femoralarterienpuls-Palpationsstelle geteilt durch die Laufzeit zwischen den Wellen (m/s) berechnet. Alle Messungen werden von demselben Untersucher durchgeführt, der gegenüber dem verwendeten ischämischen Protokoll blind ist (Intra-Observer-Variabilität = 5 %).

Die Perfusionsgrenzregion (PBR) der sublingualen arteriellen Mikrovaskulatur (Durchmesserspanne von 5 bis 25 μm) wird unter Verwendung von Sidestream-Dunkelfeld-Bildgebung (Microscan, Glycocheck, Microvascular Health Solutions Inc., Salt Lake City, UT, USA) gemessen. Die PBR ist die zellarme Schicht, die aus der Phasentrennung zwischen den fließenden roten Blutkörperchen (RBC) und dem Plasma auf der luminalen Oberfläche des Mikrogefäßes resultiert. Der PBR enthält die Komponente von Glykokalyx, die eine Zellpenetration ermöglicht. Somit steht eine verstärkt perfundierte Grenzregion (PBR) im Einklang mit einem tieferen Eindringen von Erythrozyten in die Glykokalyx, was auf einen Verlust der Glykokalyx-Barriereeigenschaften hinweist und ein Marker für eine verringerte Glykokalyx-Dicke ist. Dies stellt eine standardisierte, reproduzierbare, bedienerunabhängige Methode zur Bewertung der arteriellen Glykokalyx dar und wird daher als Mittel zur Bewertung der Endothelintegrität vorgeschlagen.

Malondialdehyd (MDA) wird spektrophotometrisch mit einem kommerziellen Kit bestimmt (Oxford Biomedical Research, Rochester Hills, Mich, kolorimetrischer Assay für Lipidperoxidation; Messbereich 1–20 nmol/l; 3,39 % und 4,75 % Intra-Assay- bzw. Inter-Assay-Variabilität ). IL-6 wird durch einen hochempfindlichen Immunoassay [humanes IL-6-Quantikinin (hohe Empfindlichkeit)] gemessen, der so niedrige Werte wie 0,094 (Intra-Assay-Variabilität < 5 %) erkennt.

MicroRNAs (Mirs) sind kleine, einzelsträngige, nicht codierende RNA-Moleküle, die 19-25 Nukleotide umfassen und die posttranskriptionelle Genexpression als Reaktion auf zelluläre oder Umweltreize regulieren [38]. Ihre Nicht-Invasivität und Stabilität im Serum ermöglicht eine sofortige Abschätzung ihrer Expression unter Verwendung archivierter Serumproben. Spezifische MiRs wurden mit der Pathogenese von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und IRI in Verbindung gebracht. MiR-144 dient als zentraler RIC-Mediator, während miR-150 und miR-499 Apoptose und Fibrose im Setting von Tiermodellen myokardialer IRI hemmen [40, 41]. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass miR-21 die Infarktgröße und den frühen Umbau des linken Ventrikels (LV) nach IRI bei Ratten reduziert. Im Gegensatz dazu übt miR-208 schädliche Wirkungen durch Hypertrophie und nachteilige Remodeling-Induktion aus. Serum-miRNA werden aus Proben unter Verwendung des NucleoSpin miRNA Plasma Kits (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Düren, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers gewonnen. Die Expressionsmuster der getesteten miRNAs und eines Haushaltsgens, U6sn, wurden quantitativ unter Verwendung von reverser Transkription und Echtzeit-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) untersucht. Stem-Loop-komplementäre DNAs (cDNAs) werden unter Verwendung von Looped-Reverse-Transcription-Primern synthetisiert, die für jede miRNA spezifisch sind. Reverse Transkription und Quantifizierung werden mit dem Mir-X™ MicroRNA Quantification Kit (Clontech Laboratories, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung des Roche Light Cycler Fluorescence Quantitative PCR System (ABI, USA) durchgeführt. Alle Proben werden dreifach amplifiziert und jedes Experiment wurde dreimal wiederholt, um die Reproduzierbarkeit zu bestätigen. Die fache Änderung des Expressionsniveaus wird unter Verwendung der 2-ΔΔCt-Methode berechnet. Die Primer für die PCR sind:

Namenssequenz miR-150 F: 5'-TCTCCCAACCCTTGTACCAGT- 3' R: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3' miR-208 F: 5'-CTTTTGGCCCGGGTTATAC-3' R: 5'-CTGACATCCTCTAGGCTGG-3' miR-144 F: 5 '-GGGGGTACAGTATAGATGAT-3' R: 5'-TGCGTGTCGTGGAGTC-3' miR-499 F: 5'-CAAAGTCTTCACTTCCCTGCCA-3' R: 5'-GATGTTTAACTCCTCTCCACGTGATC-3' miR-21 F: 5'-CCCGCCTAGCTTATCAGACTG-3' R: 5'-GCCGTCGGTGTCAACATCA-3' miR-145 F: 5'-GGCGTCCAGTTTTCCCAG-3' R: 5'-CAGTGCTGGGTCCGAGTGA-3' U6sn F: 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3' R: 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3' Einmal betrachtet als Inerte Nebenprodukte des NO-Stoffwechsels, Nitrat (NO3-) und Nitrit (NO2-), fungieren kürzlich als Recyclingsubstrate in einem Prozess der NO-Regeneration, der unabhängig von der klassischen L-Arginin-NO-Synthase ist (NOS)-Weg. Dies ist von besonderer Bedeutung bei Myokardischämie, da letztere Kaskade in hypoxischen Umgebungen zunehmend deaktiviert wird. Daher sollte der Nitrat-Nitrit (NOx)-Pool als ein Reservoir von NO-Bioaktivität wahrgenommen werden, das NOS in Zuständen mit niedriger Sauerstoffspannung ergänzt. Die Konzentration von Nitrat/Nitrit im Blutplasma wird unter Verwendung der Griess-Reaktion mit einem im Handel erhältlichen Kit (Cayman's Nitrate/Nitrite Colorimetric Assay Kit 780001) wie zuvor beschrieben bestimmt. Jede Plasmaprobe wird durch einen 10 kDa Molekulargewichts-Cutoff-Filter (Pall Nanosep® Zentrifugalvorrichtung mit Omega-Membran, Sigma Aldrich: Z722065) ultrafiltriert. Die Filter werden vor der Ultrafiltration des Plasmas mit Reinstwasser vorgespült. Dann werden 500 μl Plasma 30 Minuten lang bei 14.000 x g und 4 °C zentrifugiert. 40 μL des Filtrats werden für die Bestimmung von Nitrat/Nitrit verwendet, die Griess-Reagenzien werden hinzugefügt und die Extinktion jeder Vertiefung wurde bei 540 nm unter Verwendung des Lesegeräts Infinite 200 PRO-Serie (Tecan) gemessen. Die Konzentration von Nitrat/Nitrit wird jeweils mit einer Nitrat/Nitrit-Standardkurve unter Verwendung von Graph Pad Prism Version 7 (Graph Pad Software, Inc.) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Die Ergebnisse werden in μmol/l ausgedrückt.

Darüber hinaus werden die Prüfärzte 1 und 2 Jahre nach der Rekrutierung eine echokardiographische Studie durchführen, um zu untersuchen, ob sich die linksventrikuläre Funktion zwischen den 3 Armen der Studie (2 RIC-Protokolle und keine Intervention) unterscheidet.

Zur Analyse der Daten werden STATA v.11 und SPSS v.22 verwendet. Mit dem Shapiro-Wilk-Test wird untersucht, ob die Daten normalverteilt sind, während mit dem Levene-Test die Homoskedastizität der Daten untersucht wird. Alle nicht-parametrischen Variablen werden unter Verwendung des Wilcoxon-Tests für Vergleiche zwischen Ausgangswerten und Werten nach der Intervention verglichen und für die multivariate Analyse in Ränge umgewandelt. Bei allen Analysen verwenden die Forscher zweiseitige Tests mit p < 0,05. Die Ermittler verwenden parametrische (Pearson r) und nicht-parametrische (Spearman rho) Korrelationskoeffizienten, um Querschnittsassoziationen zu untersuchen. Eine Varianzanalyse (ANOVA) für klinische und biologische Daten wird durchgeführt, um die Unterschiede zwischen Gruppen zu testen, und alle nichtparametrischen Variablen werden in Ränge umgewandelt, bevor sie unter Verwendung einer zuvor veröffentlichten Methodik in die Analyse eingehen. ANOVA (allgemeines lineares Modell, SPSS 22, SPSS Inc, Chicago, III) für wiederholte Messungen wird angewendet für (a) Messungen der untersuchten Gefäßfunktion und biochemischer Marker (bei T0, T1, T2 und T3 für erstere und bei Grundlinie). und Beendigung des Protokolls für letzteres) mit dem Parameter Zeit als Innersubjektfaktor verwendet, und (b) um Unterschiede zwischen den beiden RIPost-Protokollen (einfache versus doppelte Inflation) und Scheinverfahren unter Verwendung eines Modells einschließlich Alter zu testen, Geschlecht, BMI, Dyslipidämie, Diabetes, Bluthochdruck, begleitende medizinische Behandlungen, Myokardinfarktlokalisation, myokardiale Enzyme und Anzahl erkrankter Koronargefäße (>70 % Stenose) als Kovariaten. Die Interaktion zwischen den Studiengruppen und den im Modell enthaltenen Kovariaten wird ebenfalls untersucht, während die F- und p-Werte der Interaktion zwischen dem Messzeitpunkt der untersuchten Marker und Studiengruppen ebenfalls berechnet werden. Die Greenhouse-Geisser-Korrektur wird verwendet, wenn die Sphärizitätsannahme, wie sie durch den Mauchly-Test bewertet wird, nicht erfüllt ist. Post-hoc-Vergleiche werden mit Bonferroni-Korrektur durchgeführt. Ein p-Wert von < 0,05 gilt als statistisch signifikant. Inter- und Intra-Observer-Variabilitäten (%) von vaskulären und biochemischen Markern werden als SD der Differenzen zwischen den ersten und zweiten Messungen berechnet und als Prozentsatz des Durchschnittswerts bei 30 gesunden Freiwilligen ausgedrückt.