Akutní a chronické účinky vzdáleného ischemického stavu na kardiovaskulární funkce

Tato studie je prospektivní, randomizovaná studie provedená na kardiologické klinice druhé univerzity ve fakultní nemocnici Attikon. Dvě stě sedmdesát pacientů se STEMI během 48 hodin po primární PCI bylo randomizováno podle dvou protokolů vzdáleného kondicionování (RIC) nebo bez jiné intervence než standardní léčby (kontrolní skupina). První protokol využívá dva ischemické stimuly nafouknutím pažní manžety obou paží při 200 mmHg po dobu 5 minut, oddělených 15 minutami, po základním hodnocení vaskulární funkce (T0). Po každém ischemickém stimulu následuje hodnocení vaskulární funkce (T1, T2) s konečným hodnocením 25 minut po druhém vypuštění manžety (T3). Druhý protokol je shodný s prvním až na vynechání druhého ischemického stimulu. Oběma protokolům předchází procedura falešného kondicionování, vynecháním nafouknutí manžety po jejich umístění kolem běžné pažní polohy. Protokol RIC bude také proveden u 30 zdravých dobrovolníků. Vzorky krve se odebírají na začátku (TO) a na konci každého protokolu (T3). Všichni pacienti jsou v sinusovém rytmu, zatímco vylučovací kritéria zahrnují Killipovu třídu > 2 během indexové události, podávání nitrátů, anamnézu předchozí známé koronární arterie nebo jiného kardiovaskulárního onemocnění, předchozí PCI nebo bypass koronární arterie (CABG), stejně jako chronický zánět a systémové onemocnění. Kromě toho vyšetřovatelé provedou dvouleté sledování za účelem posouzení a) změn kontraktility levé komory prostřednictvím odhadu systolického objemu levé komory (LVESV) pomocí echokardiografické studie b) změn endoteliálního glykokalyxu a tuhosti tepen.

Arteriální tuhost je hodnocena rychlostí karotidně-femorální pulzní vlny (PWV) pomocí arteriální tonometrie (Complior, Alam Medical, Vincennes, Francie); normální hodnoty <10 m/s. PWV se vypočítá jako vzdálenost mezi místem palpace karotidy a femorální arteriální tepny, dělená dobou průchodu mezi vlnami (m/s). Všechna měření jsou prováděna stejným vyšetřujícím, který je slepý k využívanému ischemickému protokolu (variabilita v rámci pozorovatele = 5 %).

Perfuzní hraniční oblast (PBR) sublingvální arteriální mikrovaskulatury (rozpětí průměru od 5 do 25 um) se měří pomocí zobrazování Sidestream Darkfield (Microscan, Glycocheck, Microvascular Health Solutions Inc., Salt Lake City, UT, USA). PBR je vrstva chudá na buňky, která je výsledkem fázové separace mezi proudícími červenými krvinkami (RBC) a plazmou na luminálním povrchu mikrocévy. PBR obsahuje složku glycocalyx, která umožňuje buněčnou penetraci. Zvýšená perfundovaná hraniční oblast (PBR) je tedy konzistentní s hlubší penetrací erytrocytů do glykokalyx, což ukazuje na ztrátu vlastností glykokalyxové bariéry a je markerem snížené tloušťky glykokalyx. To představuje standardizovanou, reprodukovatelnou, na operátorovi nezávislou metodu hodnocení arteriální glykokalyx, a je tedy navržena jako prostředek pro hodnocení integrity endotelu.

Malondialdehyd (MDA) se stanovuje spektrofotometricky pomocí komerční soupravy (Oxford Biomedical Research, Rochester Hills, Michigan, kolorimetrický test na peroxidaci lipidů; rozsah měření 1-20 nmol/l; 3,39 % a 4,75 % variabilita mezi testy, resp. ). IL-6 je měřen vysoce citlivým imunotestem [lidský IL-6 Quaantikinine (vysoká citlivost)], který detekuje hodnoty tak nízké, jako je 0,094 (variabilita v rámci testu <5 %).

MikroRNA (Mirs) jsou malé, jednovláknové, nekódující molekuly RNA obsahující 19-25 nukleotidů, které regulují post-transkripční genovou expresi v reakci na buněčné nebo environmentální podněty [38]. Jejich neinvazivita a stabilita v séru umožňuje rychlý odhad jejich exprese pomocí archivovaných vzorků séra. Specifické MiR se podílejí na patogenezi kardiovaskulárních onemocnění a IRI. MiR-144 slouží jako klíčový mediátor RIC, zatímco miR-150 a miR-499 inhibují apoptózu a fibrózu na zvířecích modelech IRI myokardu [40, 41]. Kromě toho bylo prokázáno, že miR-21 snižuje velikost infarktu a časnou remodelaci levé komory (LV) po IRI u potkanů. Naopak miR-208 má škodlivé účinky prostřednictvím hypertrofie a nepříznivé indukce remodelace. Sérová miRNA se získá ze vzorků pomocí soupravy NucleoSpin miRNA Plasma Kit (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Duren, Německo) podle pokynů výrobce. Vzorce exprese testovaných miRNA a provozního genu, U6sn, byly kvantitativně testovány pomocí reverzní transkripce a polymerázové řetězové reakce s reverzní transkriptázou v reálném čase (RT-PCR). Stem-loop komplementární DNA (cDNA) jsou syntetizovány pomocí smyčkových reverzních transkripčních primerů specifických pro každou miRNA. Reverzní transkripce a kvantifikace se provádí pomocí Mir-X™ MicroRNA Quantification Kit (Clontech Laboratories, USA) podle pokynů výrobce za použití Roche Light Cycler Fluorescence Quantitative PCR System (ABI, USA). Všechny vzorky jsou amplifikovány v triplikátech a každý experiment byl opakován třikrát pro potvrzení reprodukovatelnosti. Násobná změna hladiny exprese se vypočítá pomocí metody 2-AACt. Primery pro PCR jsou:

Název sekvence miR-150 F: 5'-TCTCCCAACCCTTGTACCAGT- 3' R: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3' miR-208 F: 5'-CTTTTGGCCCGGGTTATAC-3' R: 5'-CTGACATCCTCTAGGCTG4-mi '-GGGGGTACAGTATAGATGAT-3' R: 5'-TGCGTGTCGTGGAGTC-3' miR-499 F: 5'-CAAAGTCTTCACTTCCCTGCCA-3' R: 5'-GATGTTTAACTCCTCTCCACGTGATC-3' miR-23CTAG' RTGTCAG' ACTGCTTAG' 5'-CAAAGTCTTCACTTCCCTGCCA-3' 5'-GCCGTCGGTGTCAACATCA-3' miR-145 F: 5'-GGCGTCCAGTTTTCCCAG-3' R: 5'-CAGTGCTGGGTCCGAGTGA-3' U6sn F: 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3' R:3GCT'GACTCG-5'R: GACCATGTC-5' Inertní vedlejší produkty metabolismu NO, dusičnany (NO¬3-) a dusitany (NO2-) nedávno prokázaly, že fungují jako recyklační substráty v procesu regenerace NO, který je nezávislý na klasické L-arginin-NO-syntáze. (NOS) cesta. To je zvláště důležité v případě ischemie myokardu, protože tato kaskáda je v hypoxických prostředích postupně deaktivována. Zásobník dusičnanů a dusitanů (NOx) by tedy měl být vnímán jako rezervoár biologické aktivity NO, který doplňuje NOS ve stavech nízkého napětí kyslíku. Koncentrace dusičnanů/dusitanů v krevní plazmě se stanoví pomocí Griessovy reakce s komerčně dostupnou soupravou (Cayman's Nitrate/Nitrite Colorimetric Assay Kit 780001), jak jsme popsali dříve. Každý vzorek plazmy je ultrafiltrován přes 10kDa molekulární cut-off filtr (odstředivé zařízení Pall Nanosep® s membránou Omega, Sigma Aldrich: Z722065). Filtry jsou před ultrafiltrací plazmy předem propláchnuty ultračistou vodou. Poté se 500 μl plazmy odstřeďuje po dobu 30 minut při 14 000 x g při 4 °C. 40 μl filtrátu se použije pro stanovení dusičnanů/dusitanů, přidají se Griessova činidla a absorbance každé jamky se změří při 540 nm pomocí čtečky Infinite 200 PRO série (Tecan). Koncentrace dusičnan/dusitan se stanoví pomocí standardní křivky dusičnan/dusitan za použití Graph Pad prism verze 7 (Graph Pad Software, Inc.) podle pokynů výrobce. Výsledky jsou vyjádřeny v μmol/l.

Kromě toho se vyšetřovatelé chystají provést echokardiografickou studii 1 a 2 roky po náboru, aby zjistili, zda se funkce levé komory liší mezi 3 rameny studie (2 protokoly RIC a žádná intervence).

K analýze dat se používají STATA v.11 a SPSS v.22. Shapiro-Wilkův test se používá ke zkoumání, zda jsou data normálně distribuována, zatímco Leveneův test se používá ke zkoumání homoskedasticity dat. Všechny neparametrické proměnné jsou porovnávány pomocí Wilcoxonova testu pro srovnání mezi výchozími a pointervenčními hodnotami a jsou transformovány do hodnot pro multivariační analýzu. Ve všech analýzách výzkumníci používají dva tailed testy s p<0,05. Výzkumníci používají parametrické (Pearson r) a neparametrické (Spearman rho) korelační koeficienty ke zkoumání průřezových asociací. Analýza rozptylu (ANOVA) pro klinická a biologická data se provádí za účelem testování rozdílů mezi skupinami a všechny neparametrické proměnné se před vstupem do analýzy transformují do pořadí pomocí dříve publikované metodologie. ANOVA (obecný lineární model, SPSS 22, SPSS Inc, Chicago, Illinois) pro opakovaná měření se používá pro (a) měření vyšetřované vaskulární funkce a biochemických markerů (v T0, T1, T2 a T3 pro první a na výchozí hodnotě a ukončení protokolu pro druhý jmenovaný) s parametrem času použitým jako faktor v rámci subjektu a (b) k testování rozdílů mezi 2 protokoly RIPost (jednoduchá versus dvojitá inflace) a falešným postupem pomocí modelu zahrnujícího věk, pohlaví, BMI, dyslipidémie, diabetes, hypertenze, souběžné lékařské léčby, lokalizace MI, enzymy myokardu a počet nemocných koronárních cév (>70% stenóza) jako kovariáty. Rovněž je zkoumána interakce mezi studovanými skupinami a kovariáty zahrnutými v modelu, přičemž jsou také vypočteny hodnoty F a p interakce mezi časem měření zkoumaných markerů a studijními skupinami. Skleníková-Geisserova korekce se používá, když není splněn předpoklad kulovitosti, jak je posouzen Mauchlyho testem. Post hoc srovnání se provádějí s Bonferroniho korekcí. P-hodnota < 0,05 je považována za statisticky významnou. Inter- a intra-pozorovatelské variability (%) vaskulárních a biochemických markerů jsou vypočteny jako SD rozdílů mezi prvním a druhým měřením a jsou vyjádřeny jako procento průměrné hodnoty u 30 zdravých dobrovolníků.