Kauko-iskeemisen tilan akuutit ja krooniset vaikutukset sydän- ja verisuonitoimintoihin

Tämä tutkimus on prospektiivinen, satunnaistettu tutkimus, joka suoritettiin Attikonin yliopistollisen sairaalan toisella yliopiston kardiologian osastolla. Kaksisataa seitsemänkymmentä potilasta, joilla on STEMI, 48 tunnin sisällä primaarisen PCI:n jälkeen, satunnaistetaan kahteen etähoitoprotokollaan (RIC) tai ilman muuta interventiota kuin normaalihoito (kontrolliryhmä). Ensimmäinen protokolla hyödyntää kahta iskeemistä ärsykettä täyttämällä molempien käsivarsien olkavarsimansetti 200 mmHg:ssä 5 minuutin ajan 15 minuutin välein verisuonten toiminnan perustason arvioinnin (T0) jälkeen. Jokaista iskeemistä ärsykettä seuraa verisuonten toiminnan arviointi (T1, T2) ja lopullinen arviointi 25 minuuttia toisen mansetin tyhjennyksen (T3) jälkeen. Toinen protokolla on identtinen ensimmäisen kanssa, paitsi että toinen iskeeminen ärsyke jätetään pois. Molempia protokollia edeltää näennäinen ehdoinhoitomenettely, jolloin mansetin täyttö jätetään pois sen jälkeen, kun ne on asetettu tavanomaisen olkavarsiasennon ympärille. RIC-protokolla suoritetaan myös 30 terveelle vapaaehtoiselle. Verinäytteet otetaan lähtötasolla (T0) ja kunkin protokollan lopussa (T3). Kaikilla potilailla on sinusrytmi, kun taas poissulkemiskriteereitä ovat Killip-luokka > 2 indeksitapahtuman aikana, nitraattien antaminen, aikaisempi tunnettu sepelvaltimo- tai muu sydän- ja verisuonisairaus, aiempi PCI tai sepelvaltimon ohitusleikkaus (CABG) sekä krooninen tulehdus ja systeeminen sairaus. Lisäksi tutkijat aikovat suorittaa kahden vuoden seurannan arvioidakseen a) muutoksia vasemman kammion supistumiskyvyssä arvioimalla vasemman kammion pään systolinen tilavuus (LVESV) kaikukardiografiatutkimuksella b) muutokset endoteelin glykokalyyksissä ja valtimon jäykkyydessä.

Valtimon jäykkyys arvioidaan kaulavaltimon ja reisiluun pulssiaallon nopeudella (PWV) käyttämällä valtimotonometriaa (Complior, Alam Medical, Vincennes, Ranska); normaaliarvot <10 m/s. PWV lasketaan kaulavaltimon ja reisivaltimon pulssin tunnustelukohdan etäisyydeksi jaettuna aaltojen välisellä kulkuajalla (m/s). Kaikki mittaukset suorittaa sama tutkija, joka on sokea käytetylle iskeemiselle protokollalle (tarkkailijan sisäinen vaihtelu = 5 %).

Sublingvaalisen valtimon mikroverisuonten perfuusioraja-alue (PBR) (halkaisijaväli 5 - 25 μm) mitataan käyttämällä Sidestream Darkfield -kuvausta (Microscan, Glycocheck, Microvascular Health Solutions Inc., Salt Lake City, UT, USA). PBR on soluköyhä kerros, joka johtuu virtaavien punasolujen (RBC) ja plasman välisestä faasierotuksesta mikrosuonen luminaalisella pinnalla. PBR sisältää glykokalyyksin komponentin, joka mahdollistaa solujen tunkeutumisen. Siten lisääntynyt perfusoitu raja-alue (PBR) on yhdenmukainen erytrosyyttien syvemmälle tunkeutumisen kanssa glykokaliksiin, mikä osoittaa glykokalyyksin esteominaisuuksien menetystä ja on glykokalyksin paksuuden pienenemisen merkki. Tämä muodostaa standardoidun, toistettavan, käyttäjästä riippumattoman menetelmän valtimon glykokaliksin arvioimiseksi, ja siksi sitä ehdotetaan keinoksi endoteelin eheyden arvioimiseksi.

Malondialdehydi (MDA) määritetään spektrofotometrisesti kaupallisella pakkauksella (Oxford Biomedical Research, Rochester Hills, Mich, kolorimetrinen määritys lipidiperoksidaatiolle; mittausalue 1-20 nmol/L; 3,39 % ja 4,75 % määrityksen sisäinen ja määritysten välinen vaihtelu. ). IL-6 mitataan korkean herkkyyden immunomäärityksellä [ihmisen IL-6-kvantikiniini (korkea herkkyys)], joka havaitsee niinkin alhaiset arvot kuin 0,094 (määrityksen sisäinen vaihtelu <5 %).

MikroRNA:t (Mirs) ovat pieniä, yksijuosteisia, ei-koodaavia RNA-molekyylejä, jotka sisältävät 19-25 nukleotidia ja jotka säätelevät transkription jälkeistä geeniekspressiota vasteena solun tai ympäristön ärsykkeille [38]. Niiden ei-invasiivisuus ja stabiilisuus seerumissa mahdollistavat niiden ilmentymisen nopean arvioinnin käyttämällä arkistoituja seeruminäytteitä. Spesifiset MiR:t on liitetty sydän- ja verisuonitautien ja IRI:n patogeneesiin. MiR-144 toimii keskeisenä RIC-välittäjänä, kun taas miR-150 ja miR-499 estävät apoptoosia ja fibroosia sydänlihaksen IRI:n eläinmalleissa [40, 41]. Lisäksi miR-21:n on osoitettu vähentävän infarktin kokoa ja varhaista vasemman kammion (LV) uudelleenmuotoilua IRI:n jälkeen rotilla. Päinvastoin, miR-208:lla on haitallisia vaikutuksia hypertrofian ja haitallisen uudelleenmuodostumisen induktion kautta. Seerumin miRNA saadaan näytteistä käyttämällä NucleoSpin miRNA Plasma Kit -sarjaa (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Duren, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Testattujen miRNA-molekyylien ilmentymismallit ja taloudenpitogeeni, U6sn, määritettiin kvantitatiivisesti käyttämällä käänteiskopiointia ja reaaliaikaista käänteiskopioijapolymeraasiketjureaktiota (RT-PCR). Stem-loop-komplementaariset DNA:t (cDNA:t) syntetisoidaan käyttämällä kullekin miRNA:lle spesifisiä silmukalla varustettuja käänteistranskriptioalukkeita. Käänteistranskriptio ja kvantifiointi suoritetaan Mir-X™ MicroRNA Quantification Kit -sarjalla (Clontech Laboratories, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti käyttäen Roche Light Cycler Fluorescence Quantitative PCR System -järjestelmää (ABI, USA). Kaikki näytteet monistetaan kolmena rinnakkaisena ja jokainen koe toistettiin kolme kertaa toistettavuuden varmistamiseksi. Kertomusmuutos ilmentymistasossa lasketaan käyttämällä 2-ΔΔCt-menetelmää. PCR:n alukkeet ovat:

Nimisekvenssi miR-150 F: 5'-TTCCCCAACCCTTGTACCAGT- 3' R: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3' miR-208 F: 5'-CTTTTGGCCCGGGTTATAC-3' R: 5'-CTGACATCCTCTAGGCTGGG-1-3' '-GGGGGTACAGTATAGATGAT-3' R: 5'-TGCGTGTCGTGGAGTC-3' miR-499 F: 5'-CAAAGTCTTCACTTCCCTGCCA-3' R: 5'-GATGTTTAACTCCTCTCCACGTGATC-3' miR-21 F: RGACCTAGTAG-3' F: RGACCTAG. 5'-GCCGTCGGTGTCAACATCA-3' miR-145 F: 5'-GGCGTCCAGTTTTCCCAG-3' R: 5'-CAGTGCTGGGTCCGAGTGA-3' U6sn F: 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3' R: 5'-GAATTTGCTGTTCAC NO-aineenvaihdunnan inerttien sivutuotteiden, nitraatin (NO¬3-) ja nitriitin (NO2-) on viime aikoina osoitettu toimivan kierrätyssubstraatteina NO-regeneraatioprosessissa, joka on riippumaton klassisesta L-arginiini-NO-syntaasista. (NOS) polku. Tämä on erityisen tärkeää sydänlihasiskemian yhteydessä, koska jälkimmäinen kaskadi deaktivoituu asteittain hypoksisissa ympäristöissä. Siten nitraatti-nitriitti (NOx) -pooli tulisi nähdä NO:n bioaktiivisuuden säiliönä, joka täydentää NOS:ää matalan happipaineen tiloissa. Nitraatti/nitriitin pitoisuus veriplasmassa määritetään käyttämällä Griess-reaktiota kaupallisesti saatavalla pakkauksella (Cayman's Nitrate/Nitrite Colorimetric Assay Kit 780001), kuten olemme aiemmin kuvanneet. Jokainen plasmanäyte ultrasuodatetaan 10 kDa:n molekyylipainon katkaisusuodattimen läpi (Pall Nanosep® keskipakolaite Omega-kalvolla, Sigma Aldrich: Z722065). Suodattimet esihuuhdellaan Ultrapure-vedellä ennen plasman ultrasuodatusta. Sitten 500 µl plasmaa sentrifugoidaan 30 minuuttia nopeudella 14 000 x g 4 °C:ssa. 40 µl suodosta käytetään nitraatti/nitriitin määritykseen, Griess-reagenssit lisätään ja kunkin kuopan absorbanssi mitattiin aallonpituudella 540 nm käyttämällä Infinite 200 PRO series -lukijaa (Tecan). Nitraatti/nitriittipitoisuus määritetään vastaavasti nitraatti/nitriitti-standardikäyrällä käyttäen Graph Pad -prisman versiota 7 (Graph Pad Software, Inc.) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tulokset ilmaistaan ​​yksikkönä μmol/L.

Lisäksi tutkijat aikovat suorittaa kaikukardiografisen tutkimuksen 1 ja 2 vuoden kuluttua työhönotosta selvittääkseen, eroaako vasemman kammion toiminta kolmen tutkimuksen haaran välillä (2 RIC-protokollaa ja ei interventiota).

STATA v.11 ja SPSS v.22 käytetään tietojen analysointiin. Shapiro-Wilk-testillä tutkitaan, onko data jakautunut normaalisti, kun taas Levene-testillä tutkitaan datan homoskedastisuutta. Kaikkia ei-parametrisia muuttujia verrataan käyttämällä Wilcoxon-testiä perustason ja toimenpiteen jälkeisten arvojen vertailua varten, ja ne muunnetaan rankeiksi monimuuttujaanalyysiä varten. Kaikissa analyyseissä tutkijat käyttävät kahta pyrstötestiä, joiden p<0,05. Tutkijat käyttävät parametrisiä (Pearson r) ja ei-parametrisia (Spearman rho) korrelaatiokertoimia poikkileikkausassosiaatioiden tutkimiseen. Varianssianalyysi (ANOVA) kliinisille ja biologisille tiedoille suoritetaan ryhmien välisten erojen testaamiseksi, ja kaikki ei-parametriset muuttujat muunnetaan sijoituksiksi ennen analyysiin siirtymistä käyttämällä aiemmin julkaistua metodologiaa. ANOVAa (yleinen lineaarinen malli, SPSS 22, SPSS Inc, Chicago, Ill.) toistuviin mittauksiin sovelletaan (a) tutkittujen verisuonitoiminnan ja biokemiallisten markkerien mittauksiin (T0, T1, T2 ja T3 edelliselle ja lähtötasolle ja protokollan lopettaminen jälkimmäiselle) aikaparametrilla, jota käytetään aiheen sisäisenä tekijänä, ja (b) testata eroja kahden RIPost-protokollan (yksittäinen versus kaksinkertainen inflaatio) ja valemenettelyn välillä käyttämällä mallia, joka sisältää iän, sukupuoli, BMI, dyslipidemia, diabetes, verenpainetauti, samanaikaiset lääkehoidot, sydäninfarktin sijainti, sydänlihaksen entsyymit ja sairaiden sepelvaltimoiden lukumäärä (>70 % ahtauma) kovariaatteina. Myös tutkimusryhmien ja malliin sisältyvien kovariaattien välistä vuorovaikutusta tarkastellaan sekä tutkittujen markkerien ja tutkimusryhmien mittausajan vuorovaikutuksen F- ja p-arvot lasketaan. Greenhouse-Geisser-korjausta käytetään, kun palloisuusoletus, sellaisena kuin se on arvioitu Mauchlyn testillä, ei täyty. Post hoc -vertailut suoritetaan Bonferroni-korjauksella. P-arvoa < 0,05 pidetään tilastollisesti merkitsevänä. Verisuonten ja biokemiallisten markkerien havaintojen väliset ja sisäiset vaihtelut (%) lasketaan ensimmäisen ja toisen mittauksen välisten erojen SD:nä ja ilmaistaan ​​prosentteina 30 terveen vapaaehtoisen keskiarvosta.