A távoli ischaemiás állapot akut és krónikus hatásai a szív- és érrendszeri működésre

A jelen tanulmány egy prospektív, randomizált vizsgálat, amelyet az Attikon Egyetemi Kórház második egyetemi kardiológiai osztályán végeztek. Kétszázhetven STEMI-ben szenvedő beteget az elsődleges PCI után 48 órán belül randomizálnak két távoli kondicionálási (RIC) protokoll szerint, vagy a szokásos kezelésen kívül más beavatkozást nem végeznek (kontrollcsoport). Az első protokoll két ischaemiás ingert használ a brachiális mandzsetta felfújásával mindkét karban 200 Hgmm-rel 5 percig, 15 perccel elválasztva, az érrendszeri alapérték-értékelés (T0) után. Minden ischaemiás ingert érrendszeri funkció (T1, T2) követ, a végső értékelés 25 perccel a mandzsetta második leeresztése után (T3) történik. A második protokoll megegyezik az elsővel, kivéve a második ischaemiás inger elhagyását. Mindkét protokollt színlelt kondicionáló eljárás előzi meg, a mandzsetta felfújásának kihagyásával, miután a szokásos brachialis pozíció körül helyezték el őket. A RIC protokollt 30 egészséges önkéntesen is végrehajtják. Vérmintákat vesznek az alapvonalon (T0) és az egyes protokollok végén (T3). Minden beteg szinuszritmusban van, míg a kizárási kritériumok közé tartozik a Killip-osztály > 2 az indexesemény alatt, nitrátok adása, korábbi ismert koszorúér vagy egyéb szív- és érrendszeri betegség, korábbi PCI vagy coronaria bypass műtét (CABG), valamint krónikus gyulladásos és szisztémás betegség. Ezenkívül a kutatók kétéves nyomon követést fognak végezni annak érdekében, hogy felmérjék a) a bal kamra kontraktilitásának változásait a bal kamra végi szisztolés térfogatának (LVESV) echokardiográfiás vizsgálattal történő becslésével b) az endoteliális glikokalix és az artériás merevség változásait.

Az artériás merevséget a carotis-femoralis pulzushullám sebességével (PWV) mérjük artériás tonometriával (Complior, Alam Medical, Vincennes, Franciaország); normál értékek <10 m/s. A PWV-t úgy számítják ki, mint a carotis és a femoralis artériás pulzus tapintási helye közötti távolságot, osztva a hullámok közötti áthaladási idővel (m/s). Minden mérést ugyanaz a vizsgáló végzi, aki vak az ischaemiás protokollra (intra-observer variabilitás=5%).

A szublingvális artériás mikrovaszkulatúra perfúziós határrégióját (PBR) (átmérője 5-25 μm) Sidestream Darkfield képalkotással (Microscan, Glycocheck, Microvascular Health Solutions Inc., Salt Lake City, UT, USA) mérjük. A PBR a sejtszegény réteg, amely az áramló vörösvérsejtek (RBC) és a plazma közötti fázisszétválás eredménye a mikroerek luminális felületén. A PBR tartalmazza a glikokalix komponensét, amely lehetővé teszi a sejtek behatolását. Így a megnövekedett perfundált határrégió (PBR) összhangban van az eritrociták mélyebb behatolásával a glikokalixbe, ami a glikokalix gát tulajdonságainak elvesztését jelzi, és a csökkent glikokalix vastagság markere. Ez egy szabványos, reprodukálható, kezelőtől független módszer az artériás glikokalix értékelésére, és ezért az endothel integritás értékelésének eszközeként javasolt.

A malondialdehidet (MDA) spektrofotometriásan határozzák meg egy kereskedelmi készlettel (Oxford Biomedical Research, Rochester Hills, Mich, kolorimetriás assay lipid-peroxidációra; mérési tartomány 1-20 nmol/L; 3,39% és 4,75% a vizsgálaton belüli és a vizsgálatok közötti variabilitás). ). Az IL-6-ot nagy érzékenységű immunoassay-vel [humán IL-6 Quantikinine (high sensitivity)] mérik, amely akár 0,094 értéket is kimutat (intra-assay variabilitás <5%).

A mikroRNS-ek (Mirs) kicsi, egyszálú, nem kódoló RNS-molekulák, amelyek 19-25 nukleotidot tartalmaznak, és szabályozzák a poszt-transzkripciós génexpressziót sejtes vagy környezeti ingerekre adott válaszként [38]. Nem invazivitásuk és szérumbeli stabilitásuk lehetővé teszi expressziójuk gyors becslését archivált szérumminták segítségével. Specifikus MiR-ek szerepet játszanak a szív- és érrendszeri betegségek és az IRI patogenezisében. A MiR-144 kulcsfontosságú RIC közvetítőként szolgál, míg a miR-150 és a miR-499 gátolja az apoptózist és a fibrózist a szívizom IRI állatmodelljeinek beállításában [40, 41]. Ezenkívül a miR-21-ről kimutatták, hogy csökkenti az infarktus méretét és a korai bal kamrai (LV) remodellinget az IRI után patkányokban. Éppen ellenkezőleg, a miR-208 káros hatásokat fejt ki a hipertrófia és a káros remodelling indukció révén. A szérum miRNS-t a mintákból a NucleoSpin miRNA Plasma Kit (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Duren, Németország) segítségével nyerjük ki a gyártó utasításai szerint. A tesztelt miRNS-ek expressziós mintázatát és egy housekeeping gént, az U6sn-t reverz transzkripcióval és valós idejű reverz transzkriptáz polimeráz láncreakcióval (RT-PCR) kvantitatívan vizsgáltuk. Stem-loop komplementer DNS-eket (cDNS-eket) szintetizálnak minden egyes miRNS-re specifikus hurkos reverz transzkripciós primerek segítségével. A reverz transzkripció és a mennyiségi meghatározás a Mir-X™ MicroRNA Quantification Kit-tel (Clontech Laboratories, USA) történik a gyártó utasításai szerint, a Roche Light Cycler Fluorescence Quantitative PCR System (ABI, USA) segítségével. Az összes mintát háromszor amplifikáltuk, és minden kísérletet háromszor megismételtünk a reprodukálhatóság megerősítésére. Az expressziós szint többszörös változását a 2-ΔΔCt módszerrel számítjuk ki. A PCR primerei a következők:

Név Sorozat miR-150 F: 5'-TTCCCCAACCCTTGTACCAGT- 3' R: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3' miR-208 F: 5'-CTTTTGGCCCGGGTTATAC-3' R: 5'-CTGACATCCTCTAGGCTGGG-1-34 F: miR-5' '-GGGGGTACAGTATAGATGAT-3' R: 5'-TGCGTGTCGTGGAGTC-3' miR-499 F: 5'-CAAAGTCTTCACTTCCCTGCCA-3' R: 5'-GATGTTTAACTCCTCTCCACGTGATC-3' miR-21 F: RGACCTAGC-CCCAT: RGACCTAG. 5'-GCCGTCGGTGTCAACATCA-3' miR-145 F: 5'-GGCGTCCAGTTTTCCCAG-3' R: 5'-CAGTGCTGGGTCCGAGTGA-3' U6sn F: 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3' R: Egyszer mint 3'-GAATTTGCTGTTCAC Az NO-metabolizmus inert melléktermékeiről, a nitrátról (NO¬3-) és a nitritről (NO2-) a közelmúltban kimutatták, hogy újrahasznosító szubsztrátként működnek az NO-regeneráció folyamatában, amely független a klasszikus L-arginin-NO-szintáztól (NOS) útvonal. Ez különösen fontos a myocardialis ischaemia hátterében, mivel az utóbbi kaszkád fokozatosan deaktiválódik hipoxiás környezetben. Így a nitrát-nitrit (NOx) készletet az NO bioaktivitás tárolójának kell tekinteni, amely kiegészíti a NOS-t alacsony oxigénfeszültségű állapotokban. A vérplazmában a nitrát/nitrit koncentrációját Griess-reakcióval határozzuk meg egy kereskedelmi forgalomban kapható készlettel (Cayman's Nitrate/Nitrite Colorimetric Assay Kit 780001), amint azt korábban leírtuk. Minden plazmamintát ultraszűrünk egy 10 kDa molekulatömegű szűrőn (Pall Nanosep® centrifugális eszköz Omega membránnal, Sigma Aldrich: Z722065). A szűrőket Ultrapure vízzel előöblítik a plazma ultraszűrése előtt. Ezután 500 μl plazmát centrifugálunk 30 percig 14 000 x g-vel 4 °C-on. A szűrletből 40 μl-t használunk fel a nitrát/nitrit meghatározására, hozzáadjuk a Griess-reagenseket, és az egyes lyukak abszorbanciáját 540 nm-en mérjük az Infinite 200 PRO sorozat (Tecan) olvasóval. A nitrát/nitrit koncentrációját egy nitrát/nitrit standard görbével határozzuk meg a Graph Pad prizma 7-es verziójával (Graph Pad Software, Inc.) a gyártó utasításai szerint. Az eredményeket μmol/L-ben fejezzük ki.

Ezenkívül a kutatók echokardiográfiás vizsgálatot fognak végezni 1 és 2 évvel a felvételt követően, hogy megvizsgálják, hogy a bal kamrai funkció eltér-e a vizsgálat 3 ága között (2 RIC protokoll és nincs beavatkozás).

A STATA v.11 és SPSS v.22 az adatok elemzésére szolgál. A Shapiro-Wilk tesztet annak vizsgálatára használják, hogy az adatok normális eloszlásúak-e, míg a Levene teszt az adatok homoszkedaszticitásának vizsgálatára szolgál. Az összes nem paraméteres változót a Wilcoxon-teszttel hasonlítják össze az alapvonal és a beavatkozás utáni értékek összehasonlításához, és rangokká alakítják át a többváltozós elemzéshez. A kutatók minden elemzésben két farkú tesztet alkalmaznak p<0,05 értékkel. A kutatók parametrikus (Pearson r) és nem paraméteres (Spearman rho) korrelációs együtthatók segítségével vizsgálják a keresztmetszeti asszociációkat. A klinikai és biológiai adatok varianciaanalízisét (ANOVA) végzik el a csoportok közötti különbségek tesztelésére, és az összes nem paraméteres változót rangokká alakítják, mielőtt egy korábban közzétett módszertant alkalmaznának az elemzésbe. Az ismételt mérésekhez ANOVA-t (általános lineáris modell, SPSS 22, SPSS Inc, Chicago, Ill.) alkalmazunk (a) a vizsgált vaszkuláris funkció és biokémiai markerek mérésére (az előbbinél T0, T1, T2 és T3-nál, illetve kiindulási értéknél). és az utóbbi esetében a protokoll megszüntetése) az idő paraméterével, mint tárgyon belüli tényezővel, és (b) a 2 RIPost protokoll (egyszeri és kettős infláció) és a színlelt eljárás közötti különbségek tesztelése egy életkort tartalmazó modell segítségével, nem, BMI, dyslipidaemia, cukorbetegség, magas vérnyomás, egyidejű orvosi kezelések, MI helye, szívizom enzimek és a megbetegedett koszorúerek száma (>70% szűkület) mint kovariáns. Megvizsgáljuk a vizsgált csoportok és a modellben szereplő kovariánsok közötti interakciót is, valamint kiszámítjuk a vizsgált markerek és a vizsgálati csoportok mérési ideje közötti interakció F és p értékét is. A Greenhouse-Geisser korrekciót akkor alkalmazzuk, ha a Mauchly-teszttel értékelt szférikussági feltételezés nem teljesül. A post hoc összehasonlításokat Bonferroni korrekcióval végezzük. A 0,05-nél kisebb p-érték statisztikailag szignifikánsnak tekinthető. A vaszkuláris és biokémiai markerek megfigyelőközi és megfigyelőközi variabilitását (%) az első és második mérés közötti különbségek SD-jeként számítjuk ki, és 30 egészséges önkéntes átlagértékének százalékában fejezzük ki.