Острые и хронические эффекты отдаленного ишемического воздействия на сердечно-сосудистую функцию

Настоящее исследование представляет собой проспективное рандомизированное исследование, проведенное на кафедре кардиологии Второго университета в университетской больнице Аттикон. Двести семьдесят пациентов с ИМпST в течение 48 часов после первичного ЧКВ рандомизированы в два протокола дистанционного кондиционирования (ДИК) или без какого-либо вмешательства, кроме стандартного лечения (контрольная группа). Первый протокол использует два ишемических стимула путем раздувания плечевой манжеты обеих рук при 200 мм рт. ст. в течение 5 минут, разделенных 15 минутами, после базовой оценки сосудистой функции (T0). За каждым ишемическим стимулом следует оценка сосудистой функции (Т1, Т2) с окончательной оценкой через 25 минут после второго сдувания манжеты (Т3). Второй протокол идентичен первому, за исключением исключения второго ишемического стимула. Обоим протоколам предшествует процедура имитации кондиционирования, заключающаяся в отсутствии накачивания манжет после их размещения вокруг обычного плечевого положения. Протокол RIC также будет выполнен на 30 здоровых добровольцах. Образцы крови берутся на исходном уровне (T0) и в конце каждого протокола (T3). Все пациенты имеют синусовый ритм, в то время как критерии исключения включают класс Killip > 2 во время индексного события, введение нитратов, ранее известное заболевание коронарной артерии или другое сердечно-сосудистое заболевание, предшествующее ЧКВ или операцию аортокоронарного шунтирования (АКШ), а также хронические воспалительные заболевания. и системное заболевание. Кроме того, исследователи собираются провести двухлетнее наблюдение, чтобы оценить а) изменения сократительной способности левого желудочка посредством оценки конечного систолического объема левого желудочка (КСО ЛЖ) с помощью эхокардиографического исследования; б) изменения эндотелиального гликокаликса и жесткости артерий.

Артериальную жесткость оценивают по скорости каротидно-бедренной пульсовой волны (СПВ) с использованием артериальной тонометрии (Complior, Alam Medical, Венсен, Франция); нормальные значения <10 м/с. PWV рассчитывается как расстояние между местом пальпации пульса сонных и бедренных артерий, деленное на время прохождения между волнами (м/с). Все измерения выполняются одним и тем же исследователем, который не знает об используемом ишемическом протоколе (изменчивость внутри наблюдателя = 5%).

Пограничную область перфузии (PBR) подъязычного артериального микроциркуляторного русла (диаметр в диапазоне от 5 до 25 мкм) измеряют с помощью визуализации Sidestream Darkfield (Microscan, Glycocheck, Microvascal Health Solutions Inc., Солт-Лейк-Сити, Юта, США). PBR представляет собой слой с низким содержанием клеток, возникающий в результате фазового разделения между текущими эритроцитами (RBC) и плазмой на поверхности просвета микрососудов. PBR включает компонент гликокаликса, который позволяет проникать в клетки. Таким образом, увеличенная перфузируемая пограничная область (PBR) согласуется с более глубоким проникновением эритроцитов в гликокаликс, что указывает на потерю барьерных свойств гликокаликса и является маркером уменьшения толщины гликокаликса. Это представляет собой стандартизированный, воспроизводимый, независимый от оператора метод оценки артериального гликокаликса и, таким образом, предлагается в качестве средства для оценки целостности эндотелия.

Малоновый диальдегид (МДА) определяют спектрофотометрически с помощью коммерческого набора (Oxford Biomedical Research, Rochester Hills, Mich, колориметрический анализ перекисного окисления липидов; диапазон измерения 1–20 нмоль/л; 3,39% и 4,75% вариабельность внутри и между анализами соответственно ). IL-6 измеряется с помощью высокочувствительного иммунологического анализа [человеческий IL-6 Quantikinine (высокая чувствительность)], который выявляет такие низкие значения, как 0,094 (вариабельность внутри анализа <5%).

МикроРНК (Mirs) представляют собой небольшие одноцепочечные некодирующие молекулы РНК, состоящие из 19-25 нуклеотидов, которые регулируют посттранскрипционную экспрессию генов в ответ на клеточные или экологические стимулы [38]. Их неинвазивность и стабильность в сыворотке позволяет быстро оценить их экспрессию с использованием архивных образцов сыворотки. Специфические микроРНК вовлечены в патогенез сердечно-сосудистых заболеваний и ИРИ. МиР-144 служит основным медиатором RIC, в то время как миР-150 и миР-499 ингибируют апоптоз и фиброз в условиях животных моделей ИРИ миокарда [40, 41]. Кроме того, было продемонстрировано, что miR-21 уменьшает размер инфаркта и раннее ремоделирование левого желудочка (LV) после IRI у крыс. Напротив, miR-208 оказывает вредное действие посредством гипертрофии и индукции неблагоприятного ремоделирования. МикроРНК сыворотки получают из образцов с использованием набора NucleoSpin miRNA Plasma Kit (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Дюрен, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Паттерны экспрессии протестированных микроРНК и гена домашнего хозяйства U6sn количественно анализировали с использованием обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой в реальном времени (RT-PCR). Комплементарные ДНК стволовой петли (кДНК) синтезируют с использованием петлевых праймеров обратной транскрипции, специфичных для каждой микроРНК. Обратную транскрипцию и количественный анализ проводят с помощью набора для количественного определения микроРНК Mir-X™ (Clontech Laboratories, США) в соответствии с инструкцией производителя с использованием флуоресцентной количественной ПЦР-системы Roche Light Cycler (ABI, США). Все образцы амплифицировали в трех повторностях, и каждый эксперимент повторяли трижды для подтверждения воспроизводимости. Кратность изменения уровня экспрессии рассчитывают с использованием метода 2-ΔΔCt. Праймерами для ПЦР являются:

Название Последовательность miR-150 F: 5'-TCTCCCAACCCTTGTACCAGT-3' R: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3' miR-208 F: 5'-CTTTTGGCCCGGGTTATAC-3' R: 5'-CTGACATCCTCTAGGCTGG-3' miR-144 F: 5 '-GGGGGTACAGTATAGATGAT-3' R: 5'-TGCGTGTCGTGGAGTC-3' miR-499 F: 5'-CAAAGTCTTCACTTCCCTGCCA-3' R: 5'-GATGTTTAACTCCTCTCCACGTGATC-3' miR-21 F: 5'-CCCGCCTAGCTTATCAGACTG-3' R: 5'-GCCGTCGGTGTCAACATCA-3' miR-145 F: 5'-GGCGTCCAGTTTTTCCCAG-3' R: 5'-CAGTGCTGGGTCCGAGTGA-3' U6sn F: 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3' R: 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3' инертные побочные продукты метаболизма NO, нитраты (NO-3-) и нитриты (NO2-), как недавно было показано, функционируют в качестве рециклирующих субстратов в процессе регенерации NO, который не зависит от классической L-аргинин-NO-синтазы. (NOS) пути. Это имеет особое значение в условиях ишемии миокарда, поскольку последний каскад постепенно деактивируется в условиях гипоксии. Таким образом, пул нитратов и нитритов (NOx) следует воспринимать как резервуар биологической активности NO, который дополняет NOS в состояниях с низким напряжением кислорода. Концентрацию нитратов/нитритов в плазме крови определяют с помощью реакции Грисса с коммерчески доступным набором (набор для колориметрического анализа нитратов/нитритов Cayman's 780001), как мы описали ранее. Каждый образец плазмы подвергают ультрафильтрации через фильтр с отсеканием молекулярной массы 10 кДа (центробежное устройство Pall Nanosep® с мембраной Omega, Sigma Aldrich: Z722065). Перед ультрафильтрацией плазмы фильтры предварительно промывают сверхчистой водой. Затем 500 мкл плазмы центрифугируют в течение 30 минут при 14000xg при 4°C. 40 мкл фильтрата используют для определения нитратов/нитритов, добавляют реагенты Грисса и измеряют оптическую плотность каждой лунки при 540 нм с использованием ридера серии Infinite 200 PRO (Tecan). Концентрацию нитрата/нитрита определяют с помощью стандартной кривой нитрата/нитрита соответственно с использованием призмы Graph Pad версии 7 (Graph Pad Software, Inc.) в соответствии с инструкциями производителя. Результаты выражены в мкмоль/л.

Кроме того, исследователи собираются провести эхокардиографическое исследование через 1 и 2 года после набора, чтобы выяснить, различается ли функция левого желудочка в трех группах исследования (2 протокола RIC и отсутствие вмешательства).

STATA v.11 и SPSS v.22 используются для анализа данных. Тест Шапиро-Уилка используется для проверки нормальности распределения данных, тогда как тест Левена используется для проверки гомоскедастичности данных. Все непараметрические переменные сравниваются с использованием критерия Уилкоксона для сравнения исходных значений и значений после вмешательства и преобразуются в ранги для многофакторного анализа. Во всех анализах исследователи используют двусторонний критерий с p<0,05. Исследователи используют параметрические (r Пирсона) и непараметрические (rho Спирмена) коэффициенты корреляции для изучения перекрестных ассоциаций. Анализ дисперсии (ANOVA) для клинических и биологических данных выполняется для проверки различий между группами, и все непараметрические переменные преобразуются в ранги перед вводом в анализ с использованием ранее опубликованной методологии. ANOVA (общая линейная модель, SPSS 22, SPSS Inc, Чикаго, Иллинойс) для повторных измерений применяется для (а) измерений исследуемой сосудистой функции и биохимических маркеров (в Т0, Т1, Т2 и Т3 для первого и на исходном уровне). и прекращение протокола для последнего) с параметром времени, используемым в качестве внутрисубъектного фактора, и (b) для проверки различий между двумя протоколами RIPost (одиночное и двойное надувание) и фиктивной процедурой с использованием модели, включающей возраст, пол, ИМТ, дислипидемия, диабет, гипертония, сопутствующее лечение, локализация инфаркта миокарда, миокардиальные ферменты и количество пораженных коронарных сосудов (>70% стеноз) как коварианты. Также исследуется взаимодействие между исследуемыми группами и ковариатами, включенными в модель, а также рассчитываются значения F и p взаимодействия между временем измерения исследуемых маркеров и исследуемыми группами. Поправка Гринхауса-Гейссера используется, когда предположение о сферичности, оцененное с помощью теста Мочли, не выполняется. Апостериорные сравнения выполняются с поправкой Бонферрони. Значение p<0,05 считается статистически значимым. Меж- и внутринаблюдательная изменчивость (%) сосудистых и биохимических маркеров рассчитывается как стандартное отклонение различий между первым и вторым измерениями и выражается в процентах от среднего значения у 30 здоровых добровольцев.