Efectos agudos y crónicos del condicionamiento isquémico remoto sobre la función cardiovascular

El presente estudio es un ensayo aleatorio prospectivo realizado en el Departamento de Cardiología de la Segunda Universidad en el Hospital Universitario de Attikon. Doscientos setenta pacientes con STEMI, dentro de las 48 horas posteriores a la ICP primaria, se aleatorizan en dos protocolos de acondicionamiento remoto (RIC) o ninguna intervención que no sea el tratamiento estándar (grupo de control). El primer protocolo utiliza dos estímulos isquémicos mediante el inflado del manguito braquial de ambos brazos a 200 mmHg durante 5 minutos, separados por 15 minutos, después de una evaluación de la función vascular inicial (T0). Cada estímulo isquémico va seguido de una evaluación de la función vascular (T1, T2), con una evaluación final 25 minutos después del segundo desinflado del manguito (T3). El segundo protocolo es idéntico al primero, excepto por la omisión del segundo estímulo isquémico. Ambos protocolos están precedidos por un procedimiento de acondicionamiento simulado, mediante la omisión del inflado del manguito después de su colocación alrededor de la posición braquial ordinaria. El protocolo RIC también se realizará en 30 voluntarios sanos. Las muestras de sangre se extraen al inicio (T0) y al final de cada protocolo (T3). Todos los pacientes están en ritmo sinusal, mientras que los criterios de exclusión incluyen clase Killip> 2 durante el evento índice, administración de nitratos, antecedentes de enfermedad arterial coronaria conocida u otra enfermedad cardiovascular, PCI previa o cirugía de bypass de arteria coronaria (CABG), así como inflamación crónica. y enfermedad sistémica. Además, los investigadores realizarán un seguimiento de dos años para evaluar a) los cambios en la contractilidad del ventrículo izquierdo mediante la estimación del volumen sistólico final del ventrículo izquierdo (LVESV) mediante un estudio de ecocardiografía b) los cambios en el glucocáliz endotelial y la rigidez arterial.

La rigidez arterial se evalúa mediante la velocidad de la onda del pulso carotídeo-femoral (PWV) mediante tonometría arterial (Complior, Alam Medical, Vincennes, Francia); valores normales <10 m/s. La PWV se calcula como la distancia entre el sitio de palpación del pulso arterial carotídeo y femoral, dividida por el tiempo de tránsito entre ondas (m/s). Todas las mediciones son realizadas por el mismo examinador, que es ciego al protocolo isquémico explotado (variabilidad intraobservador = 5%).

La región del límite de perfusión (PBR) de la microvasculatura arterial sublingual (diámetro de 5 a 25 μm) se mide utilizando imágenes Sidestream Darkfield (Microscan, Glycocheck, Microvascular Health Solutions Inc., Salt Lake City, UT, EE. UU.). El PBR es la capa pobre en células, que resulta de la separación de fases entre los glóbulos rojos (RBC) que fluyen y el plasma en la superficie luminal de los microvasos. El PBR incluye el componente de glicocalix que permite la penetración celular. Por lo tanto, una región límite perfundida aumentada (PBR) es consistente con una penetración más profunda de los eritrocitos en el glucocáliz, lo que indica una pérdida de las propiedades de barrera del glucocáliz y es un marcador de espesor reducido del glucocáliz. Esto constituye un método estandarizado, reproducible e independiente del operador para evaluar el glucocáliz arterial y, por lo tanto, se propone como un medio para la evaluación de la integridad endotelial.

El malondialdehído (MDA) se determina espectrofotométricamente con un kit comercial (Oxford Biomedical Research, Rochester Hills, Michigan, ensayo colorimétrico para peroxidación lipídica; rango de medición 1-20 nmol/L; 3,39 % y 4,75 % de variabilidad intraensayo e interensayo respectivamente ). La IL-6 se mide mediante un inmunoensayo de alta sensibilidad [IL-6 humana quantikinina (alta sensibilidad)], que detecta valores tan bajos como 0,094 (variabilidad intraensayo <5%).

Los microARN (Mirs) son pequeñas moléculas de ARN no codificante de una sola hebra que comprenden 19-25 nucleótidos que regulan la expresión génica postranscripcional en respuesta a estímulos celulares o ambientales [38]. Su no invasividad y estabilidad en suero permite una rápida estimación de su expresión utilizando muestras de suero archivadas. MiR específicos se han implicado en la patogenia de la enfermedad cardiovascular y la IRI. MiR-144 sirve como un mediador RIC fundamental, mientras que miR-150 y miR-499 inhiben la apoptosis y la fibrosis en el entorno de modelos animales de IRI miocárdica [40, 41]. Además, se ha demostrado que miR-21 reduce el tamaño del infarto y la remodelación temprana del ventrículo izquierdo (VI) después de la IRI en ratas. Por el contrario, miR-208 ejerce efectos deletéreos a través de la hipertrofia y la inducción de remodelación adversa. Los miARN séricos se obtienen de muestras utilizando el kit de plasma de miARN NucleoSpin (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Duren, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Los patrones de expresión de los miARN probados y un gen de limpieza, U6sn, se analizaron cuantitativamente mediante transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa en tiempo real (RT-PCR). Los ADN complementarios de bucle de tallo (ADNc) se sintetizan utilizando cebadores de transcripción inversa en bucle específicos para cada miARN. La transcripción inversa y la cuantificación se realizan con el kit de cuantificación de microARN Mir-X™ (Clontech Laboratories, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante utilizando el sistema de PCR cuantitativa de fluorescencia Roche Light Cycler (ABI, EE. UU.). Todas las muestras se amplificaron por triplicado y cada experimento se repitió tres veces para confirmar la reproducibilidad. El cambio de veces en el nivel de expresión se calcula utilizando el método 2-ΔΔCt. Los cebadores para PCR son:

Nombre Secuencia miR-150 F: 5'-TCTCCCAACCCTTGTACCAGT- 3' R: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3' miR-208 F: 5'-CTTTTGGCCCGGGTTATAC-3' R: 5'-CTGACATCCTCTAGGCTGG-3' miR-144 F: 5 '-GGGGGTACAGTATAGATGAT-3' R: 5'-TGCGTGTCGTGGAGTC-3' miR-499 F: 5'-CAAAGTCTTCACTTCCCTGCCA-3' R: 5'-GATGTTTAACTCCTCTCCACGTGATC-3' miR-21 F: 5'-CCCGCCTAGCTTATCAGACTG-3' R: 5'-GCCGTCGGTGTCAACATCA-3' miR-145 F: 5'-GGCGTCCAGTTTTCCCAG-3' R: 5'-CAGTGCTGGGTCCGAGTGA-3' U6sn F: 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3' R: 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3' Una vez considerado como Se ha demostrado recientemente que los subproductos inertes del metabolismo del NO, nitrato (NO¬3-) y nitrito (NO2-), funcionan como sustratos de reciclaje en un proceso de regeneración de NO, que es independiente de la clásica L-arginina-NO-sintasa. (NOS) vía. Esto es de particular importancia en el contexto de la isquemia miocárdica, ya que esta última cascada se desactiva progresivamente en ambientes hipóxicos. Por lo tanto, la reserva de nitrato-nitrito (NOx) debe percibirse como un reservorio de bioactividad de NO que complementa a la NOS en estados de baja tensión de oxígeno. La concentración de nitrato/nitrito en el plasma sanguíneo se determina utilizando la reacción de Griess con un kit comercialmente disponible (Cayman's Nitrate/Nitrite Colorimetric Assay Kit 780001) como se ha descrito anteriormente. Cada muestra de plasma se ultrafiltra a través de un filtro de corte de peso molecular de 10 kDa (dispositivo centrífugo Pall Nanosep® con membrana Omega, Sigma Aldrich: Z722065). Los filtros se enjuagan previamente con agua ultrapura antes de la ultrafiltración del plasma. Luego, se centrifugan 500μL de plasma durante 30 minutos a 14.000xga 4°C. Se utilizan 40μL del filtrado para la determinación de nitrato/nitrito, se agregan los reactivos de Griess y se mide la absorbancia de cada pocillo a 540nm utilizando el lector Infinite 200 PRO series (Tecan). La concentración de nitrato/nitrito se determina con una curva estándar de nitrato/nitrito respectivamente utilizando Graph Pad prism versión 7 (Graph Pad Software, Inc.) según las instrucciones del fabricante. Los resultados se expresan en μmol/L.

Además, los investigadores van a realizar un estudio ecocardiográfico al año ya los 2 años del reclutamiento para investigar si la función ventricular izquierda difiere entre los 3 brazos del estudio (2 protocolos RIC y ninguna intervención).

STATA v.11 y SPSS v.22 se utilizan para analizar los datos. La prueba de Shapiro-Wilk se usa para examinar si los datos se distribuyen normalmente, mientras que la prueba de Levene se usa para examinar la homocedasticidad de los datos. Todas las variables no paramétricas se comparan mediante la prueba de Wilcoxon para las comparaciones entre los valores iniciales y posteriores a la intervención y se transforman en rangos para el análisis multivariado. En todos los análisis, los investigadores utilizan pruebas de dos colas con p<0,05. Los investigadores utilizan coeficientes de correlación paramétricos (r de Pearson) y no paramétricos (rho de Spearman) para examinar las asociaciones transversales. Se realiza un análisis de varianza (ANOVA) para datos clínicos y biológicos para probar las diferencias entre grupos y todas las variables no paramétricas se transforman en rangos antes de ingresar al análisis utilizando una metodología previamente publicada. Se aplica ANOVA (modelo lineal general, SPSS 22, SPSS Inc, Chicago, Ill) para mediciones repetidas para (a) mediciones de la función vascular examinada y marcadores bioquímicos (en T0, T1, T2 y T3 para el primero y al inicio del estudio). y finalización del protocolo para este último) con el parámetro de tiempo utilizado como factor dentro del sujeto, y (b) probar las diferencias entre los 2 protocolos RIPost (inflado simple versus inflado doble) y el procedimiento simulado utilizando un modelo que incluye edad, sexo, IMC, dislipidemia, diabetes, hipertensión, tratamientos médicos concomitantes, localización del IM, enzimas miocárdicas y número de vasos coronarios afectados (>70% estenosis) como covariables. También se examina la interacción entre los grupos de estudio y las covariables incluidas en el modelo, mientras que también se calculan los valores F y p de la interacción entre el tiempo de medición de los marcadores examinados y los grupos de estudio. La corrección de Greenhouse-Geisser se utiliza cuando no se cumple el supuesto de esfericidad, evaluado mediante la prueba de Mauchly. Las comparaciones post hoc se realizan con corrección de Bonferroni. Un valor de p <0,05 se considera estadísticamente significativo. Las variabilidades inter e intraobservador (%) de los marcadores vasculares y bioquímicos se calculan como la DE de las diferencias entre la primera y la segunda medición, y se expresan como un porcentaje del valor promedio en 30 voluntarios sanos.