심혈관 기능에 대한 원격 허혈 조절의 급성 및 만성 효과

현재 연구는 Attikon 대학 병원의 제2대학 심장과에서 실시한 전향적 무작위 시험입니다. 270명의 STEMI 환자가 1차 PCI 후 48시간 이내에 두 가지 원격 조정(RIC) 프로토콜 또는 표준 치료(대조군) 이외의 중재 없이 무작위 배정됩니다. 첫 번째 프로토콜은 기준선 혈관 기능 평가(T0) 후 15분 간격으로 5분 동안 200mmHg에서 양팔의 상완 커프 팽창에 의한 두 가지 허혈성 자극을 활용합니다. 각 허혈성 자극에 이어 혈관 기능 평가(T1, T2)가 이어지며, 두 번째 커프 수축 후 25분(T3)에 최종 평가가 이루어집니다. 두 번째 프로토콜은 두 번째 허혈성 자극의 생략을 제외하고 첫 번째 프로토콜과 동일합니다. 두 프로토콜 모두 일반적인 상완 위치 주위에 배치한 후 커프 팽창 생략을 통해 가짜 컨디셔닝 절차가 선행됩니다. RIC 프로토콜은 30명의 건강한 지원자에서도 수행됩니다. 기준선(T0)과 각 프로토콜의 종료 시점(T3)에서 혈액 샘플을 채취합니다. 모든 환자는 부비동 리듬에 있으며 제외 기준에는 인덱스 이벤트 동안 Killip 클래스> 2, 질산염 투여, 이전에 알려진 관상 동맥 또는 기타 심혈관 질환의 병력, 이전 PCI 또는 관상 동맥 우회 수술 (CABG) 및 만성 염증이 포함됩니다. 및 전신 질환. 또한 조사자들은 a) 심초음파 연구에 의한 좌심실 수축기말 부피(LVESV) 추정을 통한 좌심실 수축력의 변화 b) 내피 글리코칼릭스 및 동맥 경화의 변화를 평가하기 위해 2년 추적 조사를 실시할 예정입니다.

동맥 경직도는 동맥 안압계(Complior, Alam Medical, Vincennes, France)를 사용하여 경동맥-대퇴 맥파 속도(PWV)에 의해 평가되며; 정상 값 <10m/s. PWV는 경동맥과 대퇴동맥 맥박 촉진 부위 사이의 거리를 파동 사이의 통과 시간(m/s)으로 나눈 값으로 계산됩니다. 모든 측정은 사용된 허혈성 프로토콜에 대해 알지 못하는 동일한 검사자에 의해 수행됩니다(관찰자 내 가변성 = 5%).

설하 동맥 미세혈관(직경 범위 5~25μm)의 관류 경계 영역(PBR)은 Sidestream Darkfield 이미징(Microscan, Glycocheck, Microvascular Health Solutions Inc., Salt Lake City, UT, USA)을 사용하여 측정됩니다. PBR은 미세혈관 내강 표면에서 흐르는 적혈구(RBC)와 혈장 사이의 상분리로 인해 세포가 부족한 층입니다. PBR은 세포 침투를 허용하는 glycocalyx 성분을 포함합니다. 따라서, 증가된 관류 경계 영역(PBR)은 글리코칼릭스로의 적혈구의 더 깊은 침투와 일치하며, 이는 글리코칼릭스 장벽 특성의 손실을 나타내며 감소된 글리코칼릭스 두께의 마커입니다. 이것은 동맥 glycocalyx를 평가하는 표준화되고 재현 가능하며 운영자 독립적인 방법을 구성하므로 내피 무결성 평가 수단으로 제안됩니다.

말론디알데히드(MDA)는 상업용 키트(Oxford Biomedical Research, Rochester Hills, Mich, 지질 과산화에 대한 비색 검정; 측정 범위 1-20nmol/L; 각각 3.39% 및 4.75% 분석 내 및 분석 간 가변성)를 사용하여 분광광도계로 결정됩니다. ). IL-6은 0.094만큼 낮은 값을 검출하는 고감도 면역분석[인간 IL-6 퀀티키닌(고감도)]으로 측정됩니다(분석 내 변동성 <5%).

MicroRNA(Mirs)는 세포 또는 환경 자극에 반응하여 전사 후 유전자 발현을 조절하는 19-25개의 뉴클레오티드로 구성된 작은 단일 가닥 비코딩 RNA 분자입니다[38]. 혈청 내 비침습성 및 안정성으로 인해 보관된 혈청 샘플을 사용하여 발현을 신속하게 추정할 수 있습니다. 특정 MiR은 심혈관 질환 및 IRI의 병인에 연루되어 있습니다. MiR-144는 중추적인 RIC 매개체 역할을 하는 반면, miR-150 및 miR-499는 심근 IRI의 동물 모델 설정에서 세포자멸사 및 섬유증을 억제합니다[40, 41]. 또한, miR-21은 쥐의 IRI 후 경색 크기와 조기 좌심실(LV) 리모델링을 감소시키는 것으로 입증되었습니다. 반대로 miR-208은 비대와 불리한 리모델링 유도를 통해 유해한 효과를 발휘합니다. 제조사의 지침에 따라 NucleoSpin miRNA Plasma Kit(MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Duren, Germany)를 사용하여 샘플에서 혈청 miRNA를 얻습니다. 테스트한 miRNA와 하우스키핑 유전자인 U6sn의 발현 패턴을 역전사 및 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 사용하여 정량적으로 분석했습니다. 스템-루프 상보적 DNA(cDNA)는 각 miRNA에 특정한 루프형 역전사 프라이머를 사용하여 합성됩니다. Roche Light Cycler Fluorescence Quantitative PCR System(ABI, USA)을 사용하여 제조업체의 지시에 따라 Mir-X™ MicroRNA Quantification Kit(Clontech Laboratories, USA)로 역전사 및 정량을 수행합니다. 모든 시료는 3중으로 증폭하였으며 각 실험은 재현성을 확인하기 위해 3회 반복하였다. 발현 수준의 배수 변화는 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 계산됩니다. PCR용 프라이머는 다음과 같습니다.

이름 서열 miR-150 F: 5'-TCTCCCAACCCTGTACCAGT-3' R: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3' miR-208 F: 5'-CTTTTTGGCCCGGGTTATAC-3' R: 5'-CTGACATCCTCTAGGCTGG-3' miR-144 F: 5 '-GGGGGTACAGTATAGATGAT-3' R: 5'-TGCGTGTCGTGGAGTC-3' miR-499 F: 5'-CAAAGTCTTCACTTCCCTGCCA-3' R: 5'-GATGTTTAACTCCTCTCCACGTGATC-3' miR-21 F: 5'-CCCGCCTAGCTTATCAGACTG-3' R: 5'-GCCGTCGGTGTCAACATCA-3' miR-145 F: 5'-GGCGTCCAGTTTTCCCAG-3' R: 5'-CAGTGCTGGGTCCGAGTGA-3' U6sn F: 5'-CTGCTTCGGCAGCACA-3' R: 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3' NO 대사의 불활성 부산물, 질산염(NO3-) 및 아질산염(NO2-)은 최근에 고전적인 L-아르기닌-NO-합성 효소와 독립적인 NO 재생 과정에서 재활용 기질로 기능하는 것으로 나타났습니다. (NOS) 경로. 이것은 후자의 캐스케이드가 저산소 환경에서 점진적으로 비활성화되기 때문에 심근 허혈의 설정에서 특히 중요합니다. 따라서 질산염-아질산염(NOx) 풀은 저산소 긴장 상태에서 NOS를 보완하는 NO 생체 활성의 저장소로 인식되어야 합니다. 혈장 내 질산염/아질산염 농도는 이전에 설명한 대로 상용 키트(Cayman's Nitrate/Nitrite Colorimetric Assay Kit 780001)와 함께 Griess 반응을 사용하여 결정됩니다. 각 혈장 샘플은 10kDa 분자량 차단 필터(Omega 멤브레인이 있는 Pall Nanosep® 원심 장치, Sigma Aldrich: Z722065)를 통해 한외여과됩니다. 필터는 플라즈마의 초여과 전에 초순수로 미리 헹구어집니다. 그런 다음 500μL의 혈장을 4oC에서 14.000xg로 30분 동안 원심분리합니다. 40μL의 여액을 질산염/아질산염 측정에 사용하고, Griess 시약을 첨가하고 판독기 Infinite 200 PRO 시리즈(Tecan)를 사용하여 540nm에서 각 웰의 흡광도를 측정했습니다. 질산염/아질산염의 농도는 제조업체의 지침에 따라 Graph Pad 프리즘 버전 7(Graph Pad Software, Inc.)을 사용하여 각각 질산염/아질산염 표준 곡선으로 결정됩니다. 결과는 μmol/L로 표시됩니다.

또한 조사관은 모집 후 1년 및 2년에 심초음파 연구를 수행하여 연구의 3개 부문(2 RIC 프로토콜 및 중재 없음) 간에 좌심실 기능이 다른지 여부를 조사할 예정입니다.

STATA v.11 및 SPSS v.22는 데이터 분석에 사용됩니다. Shapiro-Wilk 검정은 데이터가 정규 분포를 따르는지 여부를 검사하는 데 사용되는 반면 Levene 검정은 데이터의 동분산성을 검사하는 데 사용됩니다. 모든 비모수 변수는 Wilcoxon 테스트를 사용하여 기준 값과 개입 후 값을 비교하고 다변량 분석을 위해 순위로 변환합니다. 모든 분석에서 연구자들은 p<0.05인 양측 테스트를 사용합니다. 조사관은 단면적 연관성을 조사하기 위해 모수(Pearson r) 및 비모수(Spearman rho) 상관 계수를 사용합니다. 임상 및 생물학적 데이터에 대한 분산 분석(ANOVA)은 그룹 간의 차이를 테스트하기 위해 수행되며 모든 비모수 변수는 이전에 발표된 방법론을 사용하여 분석에 들어가기 전에 순위로 변환됩니다. 반복 측정을 위한 ANOVA(일반 선형 모델, SPSS 22, SPSS Inc, Chicago, Ill)는 (a) 검사된 혈관 기능 및 생화학적 마커의 측정에 적용됩니다(전자의 경우 T0, T1, T2 및 T3에서 그리고 기준선에서). 및 후자에 대한 프로토콜의 종료) 대상 내 요인으로 사용되는 시간 매개 변수와 함께 (b) 2개의 RIPost 프로토콜(단일 팽창 대 이중 팽창)과 나이를 포함한 모델을 사용하는 가짜 절차 간의 차이를 테스트하기 위해, 성별, BMI, 이상지질혈증, 당뇨병, 고혈압, 수반되는 의학적 치료, MI 위치, 심근 효소 및 병든 관상 혈관 수(>70% 협착)를 공변량으로 합니다. 스터디 그룹과 모델에 포함된 공변량 간의 상호 작용도 조사하고, 조사된 마커의 측정 시간과 스터디 그룹 간의 상호 작용의 F 및 p 값도 계산합니다. Greenhouse-Geisser 보정은 Mauchly 테스트로 평가한 구형도 가정이 충족되지 않을 때 사용됩니다. 사후 비교는 Bonferroni 보정으로 수행됩니다. 0.05 미만의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다. 혈관 및 생화학적 마커의 관찰자 간 및 관찰자 내 가변성(%)은 첫 번째 측정과 두 번째 측정 간의 차이의 SD로 계산되고 30명의 건강한 지원자의 평균값에 대한 백분율로 표시됩니다.