Os efeitos agudos e crônicos do condicionamento isquêmico remoto na função cardiovascular

O presente estudo é um estudo prospectivo randomizado realizado no Second University Department of Cardiology no Attikon University Hospital. Duzentos e setenta pacientes com STEMI, dentro de 48 horas após a ICP primária, são randomizados em dois protocolos de condicionamento remoto (RIC) ou nenhuma intervenção além do tratamento padrão (grupo controle). O primeiro protocolo utiliza dois estímulos isquêmicos por insuflação do manguito braquial de ambos os braços a 200 mmHg por 5 minutos, separados por 15 minutos, após avaliação da função vascular basal (T0). Cada estímulo isquêmico é seguido por uma avaliação da função vascular (T1, T2), com avaliação final 25 minutos após a segunda deflação do manguito (T3). O segundo protocolo é idêntico ao primeiro, exceto pela omissão do segundo estímulo isquêmico. Ambos os protocolos são precedidos por um procedimento de condicionamento simulado, por meio da omissão da insuflação do manguito após sua colocação em torno da posição braquial comum. O protocolo RIC também será realizado em 30 voluntários saudáveis. As amostras de sangue são coletadas na linha de base (T0) e no final de cada protocolo (T3). Todos os pacientes estão em ritmo sinusal, enquanto os critérios de exclusão incluem Killip classe> 2 durante o evento índice, administração de nitratos, história de artéria coronária conhecida prévia ou outra doença cardiovascular, ICP ou cirurgia de revascularização do miocárdio (CABG) prévia, bem como inflamação crônica e doença sistêmica. Além disso, os investigadores vão realizar um acompanhamento de dois anos para avaliar a) alterações na contratilidade ventricular esquerda por meio da estimativa do volume sistólico final do ventrículo esquerdo (LVESV) por estudo ecocardiográfico b) alterações no glicocálix endotelial e rigidez arterial.

A rigidez arterial é avaliada pela velocidade da onda de pulso carotídeo-femoral (VOP) usando tonometria arterial (Complior, Alam Medical, Vincennes, França); valores normais <10 m/s. A PWV é calculada como a distância entre o local de palpação do pulso arterial carotídeo e femoral, dividida pelo tempo de trânsito entre as ondas (m/s). Todas as medidas são realizadas pelo mesmo examinador, que não conhece o protocolo isquêmico utilizado (variabilidade intra-observador=5%).

A região limite de perfusão (PBR) da microvasculatura arterial sublingual (diâmetro de 5 a 25 μm) é medida usando imagens Sidestream Darkfield (Microscan, Glycocheck, Microvascular Health Solutions Inc., Salt Lake City, UT, EUA). O PBR é a camada pobre em células, resultante da separação de fase entre o fluxo de glóbulos vermelhos (RBC) e o plasma na superfície luminal do microvaso. O PBR inclui o componente do glicocálice que permite a penetração celular. Assim, um aumento da região limítrofe perfundida (PBR) é consistente com a penetração mais profunda dos eritrócitos no glicocálice, indicando uma perda das propriedades de barreira do glicocálice e é um marcador de redução da espessura do glicocálice. Isso constitui um método padronizado, reprodutível e independente do operador para avaliar o glicocálice arterial e, portanto, é proposto como um meio de avaliação da integridade endotelial.

Malondialdeído (MDA) é determinado espectrofotometricamente com um kit comercial (Oxford Biomedical Research, Rochester Hills, Mich, ensaio colorimétrico para peroxidação lipídica; faixa de medição 1-20 nmol/L; 3,39% e 4,75% de variabilidade intra-ensaio e inter-ensaio, respectivamente ). A IL-6 é medida por um imunoensaio de alta sensibilidade [quantininina humana de IL-6 (alta sensibilidade)], que detecta valores tão baixos quanto 0,094 (variabilidade intra-ensaio <5%).

MicroRNAs (Mirs) são pequenas moléculas de RNA não codificantes, de fita simples, compreendendo 19-25 nucleotídeos que regulam a expressão gênica pós-transcricional em resposta a estímulos celulares ou ambientais [38]. Sua capacidade não invasiva e estabilidade no soro permitem uma estimativa imediata de sua expressão usando amostras de soro arquivadas. MiRs específicos foram implicados na patogênese da doença cardiovascular e IRI. O miR-144 serve como um mediador central do RIC, enquanto o miR-150 e o miR-499 inibem a apoptose e a fibrose no cenário de modelos animais de IRI do miocárdio [40, 41]. Além disso, demonstrou-se que o miR-21 reduz o tamanho do infarto e a remodelação precoce do ventrículo esquerdo (LV) após IRI em ratos. Ao contrário, o miR-208 exerce efeitos deletérios por meio de hipertrofia e indução de remodelamento adverso. Os miRNA séricos são obtidos de amostras usando o kit NucleoSpin miRNA Plasma (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Duren, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Os padrões de expressão dos miRNAs testados e um gene de manutenção, U6sn, foram ensaiados quantitativamente usando transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase com transcriptase reversa em tempo real (RT-PCR). Os DNAs complementares de haste-alça (cDNAs) são sintetizados usando iniciadores de transcrição reversa em loop específicos para cada miRNA. A transcrição reversa e a quantificação são realizadas com o Mir-X™ MicroRNA Quantification Kit (Clontech Laboratories, EUA) de acordo com as instruções do fabricante usando o Roche Light Cycler Fluorescence Quantitative PCR System (ABI, EUA). Todas as amostras são amplificadas em triplicata e cada experimento foi repetido três vezes para confirmar a reprodutibilidade. A mudança de dobra no nível de expressão é calculada usando o método 2-ΔΔCt. Os primers para PCR são:

Sequência de Nomes miR-150 F: 5'-TCTCCCAACCCTTGTACCAGT- 3' R: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3' miR-208 F: 5'-CTTTTGGCCCGGGTTATAC-3' R: 5'-CTGACATCCTCTAGGCTGG-3' miR-144 F: 5 '-GGGGGTACAGTATAGATGAT-3' R: 5'-TGCGTGTCGTGGAGTC-3' miR-499 F: 5'-CAAAGTCTTCACTTCCCTGCCA-3' R: 5'-GATGTTTAACTCCTCTCCACGTGATC-3' miR-21 F: 5'-CCCGCCTAGCTTATCAGACTG-3' R: 5'-GCCGTCGGTGTCAACATCA-3' miR-145 F: 5'-GGCGTCCAGTTTTCCCAG-3' R: 5'-CAGTGCTGGGTCCGAGTGA-3' U6sn F: 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3' R: 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3' Uma vez considerado como subprodutos inertes do metabolismo do NO, o nitrato (NO¬3-) e o nitrito (NO2-) demonstraram recentemente funcionar como substratos de reciclagem em um processo de regeneração do NO, que é independente da clássica L-arginina-NO-sintase (NOS). Isso é de particular importância no cenário de isquemia miocárdica, pois a última cascata é progressivamente desativada em ambientes hipóxicos. Assim, o pool de nitrato-nitrito (NOx) deve ser percebido como um reservatório de bioatividade de NO que complementa a NOS em estados de baixa tensão de oxigênio. A concentração de nitrato/nitrito no plasma sanguíneo é determinada usando a reação de Griess com um kit disponível comercialmente (Cayman's Nitrate/Nitrite Colorimetric Assay Kit 780001) conforme descrito anteriormente. Cada amostra de plasma é ultrafiltrada através de um filtro de corte de peso molecular de 10 kDa (dispositivo centrífugo Pall Nanosep® com membrana Omega, Sigma Aldrich: Z722065). Os filtros são pré-lavados com água Ultrapure antes da ultrafiltração do plasma. Em seguida, 500μL de plasma são centrifugados por 30 minutos a 14.000xg a 4oC. 40μL do filtrado são usados ​​para a determinação de nitrato/nitrito, os reagentes de Griess são adicionados e a absorbância de cada poço é medida a 540nm usando o leitor Infinite 200 PRO series (Tecan). A concentração de nitrato/nitrito é determinada com uma curva padrão de nitrato/nitrito, respectivamente, usando o prisma Graph Pad versão 7 (Graph Pad Software, Inc.) de acordo com as instruções do fabricante. Os resultados são expressos em μmol/L.

Além disso, os investigadores vão realizar um estudo ecocardiográfico 1 e 2 anos após o recrutamento para investigar se a função ventricular esquerda difere entre os 3 braços do estudo (2 protocolos RIC e nenhuma intervenção).

STATA v.11 e SPSS v.22 são usados ​​para analisar os dados. O teste de Shapiro-Wilk é usado para examinar se os dados são normalmente distribuídos, enquanto o teste de Levene é usado para examinar a homocedasticidade dos dados. Todas as variáveis ​​não paramétricas são comparadas usando o teste de Wilcoxon para comparações entre os valores basais e pós-intervenção e são transformadas em classificações para análise multivariada. Em todas as análises, os pesquisadores usam testes de duas caudas com p<0,05. Os investigadores usam coeficientes de correlação paramétricos (Pearson r) e não paramétricos (Spearman rho) para examinar associações transversais. A análise de variância (ANOVA) para dados clínicos e biológicos é realizada para testar as diferenças entre os grupos e todas as variáveis ​​não paramétricas são transformadas em classificações antes de entrar na análise usando uma metodologia publicada anteriormente. ANOVA (modelo linear geral, SPSS 22, SPSS Inc, Chicago, III) para medições repetidas é aplicada para (a) medições da função vascular examinada e marcadores bioquímicos (em T0, T1, T2 e T3 para o primeiro e na linha de base e término do protocolo para o último) com o parâmetro de tempo usado como um fator dentro do assunto, e (b) para testar diferenças entre os 2 protocolos RIPost (inflação simples versus dupla) e procedimento simulado usando um modelo incluindo idade, sexo, IMC, dislipidemia, diabetes, hipertensão, tratamentos médicos concomitantes, localização do IM, enzimas miocárdicas e número de vasos coronários doentes (>70% de estenose) como covariáveis. A interação entre os grupos de estudo e as covariáveis ​​incluídas no modelo também são examinadas, enquanto os valores de F e p da interação entre o tempo de medição dos marcadores examinados e os grupos de estudo também são calculados. A correção de Greenhouse-Geisser é utilizada quando a suposição de esfericidade, avaliada pelo teste de Mauchly, não é atendida. Comparações post hoc são realizadas com correção de Bonferroni. Um valor p<0,05 é considerado estatisticamente significativo. As variabilidades inter e intra-observador (%) dos marcadores vasculares e bioquímicos são calculadas como o DP das diferenças entre a primeira e a segunda medição e são expressas como uma porcentagem do valor médio em 30 voluntários saudáveis.