Gli effetti acuti e cronici del condizionamento ischemico remoto sulla funzione cardiovascolare

Il presente studio è uno studio prospettico randomizzato condotto presso il Dipartimento di Cardiologia della Seconda Università dell'Attikon University Hospital. Duecentosettanta pazienti con STEMI, entro 48 ore dal PCI primario sono randomizzati in due protocolli di condizionamento remoto (RIC) o nessun intervento diverso dal trattamento standard (gruppo di controllo). Il primo protocollo utilizza due stimoli ischemici mediante gonfiaggio della cuffia brachiale di entrambe le braccia a 200 mmHg per 5 minuti, separati da 15 minuti, dopo una valutazione della funzione vascolare di base (T0). Ogni stimolo ischemico è seguito da una valutazione della funzione vascolare (T1, T2), con valutazione finale 25 minuti dopo il secondo sgonfiamento della cuffia (T3). Il secondo protocollo è identico al primo, fatta eccezione per l'omissione del secondo stimolo ischemico. Entrambi i protocolli sono preceduti da una finta procedura di condizionamento, mediante l'omissione del gonfiaggio del bracciale dopo il loro posizionamento attorno alla normale posizione brachiale. Il protocollo RIC sarà eseguito anche su 30 volontari sani. I campioni di sangue vengono prelevati al basale (T0) e al termine di ciascun protocollo (T3). Tutti i pazienti sono in ritmo sinusale, mentre i criteri di esclusione includono la classe Killip> 2 durante l'evento indice, la somministrazione di nitrati, la storia di precedenti malattie coronariche note o altre malattie cardiovascolari, precedenti PCI o interventi chirurgici di bypass coronarico (CABG), nonché infiammazione cronica e malattia sistemica. Inoltre, gli investigatori condurranno un follow-up di due anni per valutare a) i cambiamenti nella contrattilità ventricolare sinistra tramite la stima del volume sistolico ventricolare sinistro (LVESV) mediante studio ecocardiografico b) i cambiamenti nel glicocalice endoteliale e la rigidità arteriosa.

La rigidità arteriosa viene valutata mediante la velocità dell'onda del polso carotido-femorale (PWV) utilizzando la tonometria arteriosa (Complior, Alam Medical, Vincennes, Francia); valori normali <10 m/s. PWV è calcolato come la distanza tra il sito di palpazione del polso arterioso carotideo e femorale, diviso per il tempo di transito tra le onde (m/s). Tutte le misurazioni sono eseguite dallo stesso esaminatore, che è cieco rispetto al protocollo ischemico utilizzato (variabilità intra-osservatore=5%).

La regione di confine della perfusione (PBR) della microvascolarizzazione arteriosa sublinguale (diametro compreso tra 5 e 25 μm) viene misurata utilizzando l'imaging Sidestream Darkfield (Microscan, Glycocheck, Microvascular Health Solutions Inc., Salt Lake City, UT, USA). Il PBR è lo strato povero di cellule, risultante dalla separazione di fase tra i globuli rossi che scorrono (RBC) e il plasma sulla superficie luminale dei microvasi. Il PBR include il componente del glicocalice che consente la penetrazione cellulare. Pertanto, un aumento della regione di confine perfusa (PBR) è coerente con una penetrazione più profonda degli eritrociti nel glicocalice, indicando una perdita delle proprietà di barriera del glicocalice ed è un marker di ridotto spessore del glicocalice. Ciò costituisce un metodo standardizzato, riproducibile, indipendente dall'operatore per valutare il glicocalice arterioso e viene quindi proposto come mezzo per la valutazione dell'integrità endoteliale.

La malondialdeide (MDA) è determinata spettrofotometricamente con un kit commerciale (Oxford Biomedical Research, Rochester Hills, Mich, test colorimetrico per la perossidazione lipidica; intervallo di misurazione 1-20 nmol/L; variabilità intra-dosaggio e inter-saggio rispettivamente del 3,39% e 4,75% ). L'IL-6 viene misurata mediante un dosaggio immunologico ad alta sensibilità [quantchinina IL-6 umana (alta sensibilità)], che rileva valori fino a 0,094 (variabilità intra-dosaggio <5%).

I microRNA (Mirs) sono piccole molecole di RNA a filamento singolo, non codificanti, comprendenti 19-25 nucleotidi che regolano l'espressione genica post-trascrizionale in risposta a stimoli cellulari o ambientali [38]. La loro non invasività e stabilità nel siero consente una stima tempestiva della loro espressione utilizzando campioni di siero archiviati. MiR specifici sono stati implicati nella patogenesi delle malattie cardiovascolari e dell'IRI. MiR-144 funge da mediatore RIC cardine, mentre miR-150 e miR-499 inibiscono l'apoptosi e la fibrosi nell'impostazione di modelli animali di IRI miocardico [40, 41]. Inoltre, è stato dimostrato che miR-21 riduce le dimensioni dell'infarto e il rimodellamento del ventricolo sinistro (LV) precoce dopo IRI nei ratti. Al contrario, miR-208 esercita effetti deleteri mediante ipertrofia e induzione di rimodellamento avverso . I miRNA sierici sono ottenuti da campioni utilizzando il NucleoSpin miRNA Plasma Kit (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Duren, Germania) secondo le istruzioni del produttore. I modelli di espressione dei miRNA testati e un gene di pulizia, U6sn, sono stati analizzati quantitativamente utilizzando la trascrizione inversa e la reazione a catena della polimerasi della trascrittasi inversa in tempo reale (RT-PCR). I DNA complementari stem-loop (cDNA) sono sintetizzati utilizzando primer di trascrizione inversa in loop specifici per ciascun miRNA. La trascrizione inversa e la quantificazione vengono eseguite con il kit di quantificazione del microRNA Mir-X™ (Clontech Laboratories, USA) secondo le istruzioni del produttore utilizzando il sistema PCR quantitativo a fluorescenza Roche Light Cycler (ABI, USA). Tutti i campioni sono amplificati in triplicato e ogni esperimento è stato ripetuto tre volte per confermare la riproducibilità. La variazione di piega nel livello di espressione viene calcolata utilizzando il metodo 2-ΔΔCt. I primer per la PCR sono:

Nome Sequenza miR-150 F: 5'-TCTCCCAACCCTTGTACCAGT- 3' R: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3' miR-208 F: 5'-CTTTTGGCCCGGGTTATAC-3' R: 5'-CTGACATCTCTAGGCTGG-3' miR-144 F: 5 '-GGGGGTACAGTATAGATGAT-3' R: 5'-TGCGTGTCGTGGAGTC-3' miR-499 F: 5'-CAAAGTCTTCACTTCCCTGCCA-3' R: 5'-GATGTTTAACTCCTCTCCACGTGATC-3' miR-21 F: 5'-CCCGCCTAGCTTATCAGACTG-3' R: 5'-GCCGTCGGTGTCAACATCA-3' miR-145 F: 5'-GGCGTCCAGTTTTCCCAG-3' R: 5'-CATGCTGGGTCCGAGTGA-3' U6sn F: 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3' R: 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3' Una volta considerato come è stato recentemente dimostrato che i sottoprodotti inerti del metabolismo dell'NO, nitrato (NO¬3-) e nitrito (NO2-) funzionano come substrati di riciclo in un processo di rigenerazione dell'NO, che è indipendente dalla classica L-arginina-NO-sintasi (NOS) percorso. Ciò è di particolare importanza nel contesto dell'ischemia miocardica, poiché quest'ultima cascata viene progressivamente disattivata in ambienti ipossici. Pertanto, il pool di nitrati-nitriti (NOx) dovrebbe essere percepito come un serbatoio di bioattività NO che integra NOS in stati di bassa tensione di ossigeno. La concentrazione di nitrati/nitriti nel plasma sanguigno viene determinata usando la reazione di Griess con un kit disponibile in commercio (Kit di analisi colorimetrica per nitrati/nitriti di Cayman 780001) come descritto in precedenza. Ogni campione di plasma viene ultrafiltrato attraverso un filtro cut-off di peso molecolare di 10 kDa (dispositivo centrifugo Pall Nanosep® con membrana Omega, Sigma Aldrich: Z722065). I filtri vengono pre-risciacquati con acqua ultrapura prima dell'ultrafiltrazione del plasma. Quindi, 500μL di plasma vengono centrifugati per 30 minuti a 14.000xg a 4οC. 40μL di filtrato sono stati utilizzati per la determinazione del nitrato/nitrito, sono stati aggiunti i reagenti di Griess e l'assorbanza di ciascun pozzetto è stata misurata a 540nm utilizzando il lettore serie Infinite 200 PRO (Tecan). La concentrazione di nitrati/nitriti viene determinata rispettivamente con una curva standard nitrati/nitriti utilizzando il prisma Graph Pad versione 7 (Graph Pad Software, Inc.) secondo le istruzioni del produttore. I risultati sono espressi in μmol/L.

Inoltre, i ricercatori eseguiranno uno studio ecocardiografico a 1 e 2 anni dopo il reclutamento per verificare se la funzione ventricolare sinistra differisce tra i 3 bracci dello studio (2 protocolli RIC e nessun intervento).

STATA v.11 e SPSS v.22 vengono utilizzati per analizzare i dati. Il test di Shapiro-Wilk viene utilizzato per esaminare se i dati sono distribuiti normalmente, mentre il test di Levene viene utilizzato per esaminare l'omoschedasticità dei dati. Tutte le variabili non parametriche vengono confrontate utilizzando il test di Wilcoxon per il confronto tra i valori basali e post-intervento e vengono trasformate in ranghi per l'analisi multivariata. In tutte le analisi, i ricercatori utilizzano test a due code con p<0,05. I ricercatori utilizzano coefficienti di correlazione parametrici (Pearson r) e non parametrici (Spearman rho) per esaminare le associazioni trasversali. L'analisi della varianza (ANOVA) per i dati clinici e biologici viene eseguita per testare le differenze tra i gruppi e tutte le variabili non parametriche vengono trasformate in ranghi prima di entrare nell'analisi utilizzando una metodologia precedentemente pubblicata. ANOVA (modello lineare generale, SPSS 22, SPSS Inc, Chicago, Ill) per misurazioni ripetute viene applicato per (a) misurazioni della funzione vascolare esaminata e marcatori biochimici (a T0, T1, T2 e T3 per la prima e al basale e cessazione del protocollo per quest'ultimo) con il parametro del tempo utilizzato come fattore all'interno del soggetto, e (b) per testare le differenze tra i 2 protocolli RIPost (singola contro doppia inflazione) e la procedura fittizia utilizzando un modello che include l'età, sesso, indice di massa corporea, dislipidemia, diabete, ipertensione, trattamenti medici concomitanti, localizzazione dell'IM, enzimi miocardici e numero di vasi coronarici malati (>70% di stenosi) come covariate. Viene inoltre esaminata l'interazione tra i gruppi di studio e le covariate incluse nel modello, mentre vengono calcolati anche i valori F e p dell'interazione tra tempo di misura dei marcatori esaminati e gruppi di studio. La correzione Greenhouse-Geisser viene utilizzata quando l'ipotesi di sfericità, valutata dal test di Mauchly, non è soddisfatta. I confronti post hoc vengono eseguiti con la correzione di Bonferroni. Un p-value <0,05 è considerato statisticamente significativo. Le variabilità inter e intra-osservatore (%) dei marcatori vascolari e biochimici sono calcolate come SD delle differenze tra la prima e la seconda misurazione e sono espresse come percentuale del valore medio in 30 volontari sani.