Ostre i przewlekłe skutki zdalnego warunkowania niedokrwiennego na czynność układu sercowo-naczyniowego

Niniejsze badanie jest prospektywnym, randomizowanym badaniem przeprowadzonym na II Klinice Kardiologii Uniwersyteckiego Szpitala Uniwersyteckiego Attikon. Dwustu siedemdziesięciu pacjentów ze STEMI w ciągu 48 godzin po pierwotnej PCI przydzielono losowo do dwóch protokołów zdalnego kondycjonowania (RIC) lub bez interwencji innej niż leczenie standardowe (grupa kontrolna). Pierwszy protokół wykorzystuje dwa bodźce niedokrwienne poprzez napełnienie mankietu ramiennego obu ramion przy 200 mmHg przez 5 minut, w odstępie 15 minut, po podstawowej ocenie funkcji naczyniowych (T0). Po każdym bodźcu niedokrwiennym następuje ocena czynności naczyń (T1, T2), z końcową oceną 25 minut po drugim opróżnieniu mankietu (T3). Drugi protokół jest identyczny z pierwszym, z wyjątkiem pominięcia drugiego bodźca niedokrwiennego. Oba protokoły poprzedzone są pozorowaną procedurą kondycjonowania, polegającą na pominięciu napełnienia mankietu po założeniu go w normalnej pozycji na ramieniu. Protokół RIC zostanie również przeprowadzony u 30 zdrowych ochotników. Próbki krwi pobiera się na linii podstawowej (T0) i na końcu każdego protokołu (T3). Wszyscy pacjenci mają rytm zatokowy, a kryteria wykluczenia obejmują klasę Killipa >2 podczas zdarzenia indeksowego, podawanie azotanów, wcześniejszą rozpoznaną chorobę wieńcową lub inną chorobę sercowo-naczyniową, przebytą PCI lub operację pomostowania aortalno-wieńcowego (CABG), a także przewlekłe zapalenie i choroba ogólnoustrojowa. Ponadto badacze zamierzają przeprowadzić dwuletnią obserwację w celu oceny a) zmian kurczliwości lewej komory poprzez oszacowanie końcowej objętości skurczowej lewej komory (LVESV) metodą badania echokardiograficznego b) zmian glikokaliksu śródbłonka i sztywności tętnic.

Sztywność tętnic ocenia się na podstawie prędkości fali tętna tętnicy szyjnej i udowej (PWV) przy użyciu tonometrii tętniczej (Complior, Alam Medical, Vincennes, Francja); wartości normalne <10 m/s. PWV oblicza się jako odległość między miejscem badania tętna na tętnicy szyjnej i udowej, podzieloną przez czas przejścia między falami (m/s). Wszystkie pomiary są wykonywane przez tego samego badacza, który nie zna stosowanego protokołu niedokrwiennego (zmienność wewnątrzobserwacyjna = 5%).

Obszar graniczny perfuzji (PBR) podjęzykowego mikrokrążenia tętniczego (rozpiętość średnicy od 5 do 25 μm) mierzy się za pomocą obrazowania Sidestream Darkfield (Microscan, Glycocheck, Microvascular Health Solutions Inc., Salt Lake City, UT, USA). PBR jest warstwą ubogą w komórki, wynikającą z rozdziału faz między przepływającymi krwinkami czerwonymi (RBC) a osoczem na powierzchni światła mikronaczyń. PBR zawiera składnik glikokaliksu, który umożliwia penetrację komórek. Zatem zwiększony region graniczny perfuzji (PBR) jest zgodny z głębszą penetracją erytrocytów do glikokaliksu, co wskazuje na utratę właściwości barierowych glikokaliksu i jest markerem zmniejszonej grubości glikokaliksu. Stanowi to znormalizowaną, powtarzalną, niezależną od operatora metodę oceny glikokaliksu tętniczego i dlatego jest proponowana jako środek do oceny integralności śródbłonka.

Dwualdehyd malonowy (MDA) oznacza się spektrofotometrycznie za pomocą dostępnego w handlu zestawu (Oxford Biomedical Research, Rochester Hills, Michigan, test kolorymetryczny peroksydacji lipidów; zakres pomiarowy 1-20 nmol/L; odpowiednio 3,39% i 4,75% zmienności wewnątrz testu i między testami ). IL-6 mierzy się za pomocą testu immunologicznego o wysokiej czułości [ludzka IL-6 kwantikinina (wysoka czułość)], który wykrywa wartości tak niskie jak 0,094 (zmienność wewnątrz testu <5%).

MikroRNA (Mirs) to małe, jednoniciowe, niekodujące cząsteczki RNA zawierające 19-25 nukleotydów, które regulują potranskrypcyjną ekspresję genów w odpowiedzi na bodźce komórkowe lub środowiskowe [38]. Ich nieinwazyjność i stabilność w surowicy pozwala na szybką ocenę ich ekspresji przy użyciu archiwalnych próbek surowicy. Specyficzne MiR są zaangażowane w patogenezę chorób sercowo-naczyniowych i IRI. MiR-144 służy jako kluczowy mediator RIC, podczas gdy miR-150 i miR-499 hamują apoptozę i włóknienie w warunkach zwierzęcych modeli IRI mięśnia sercowego [40, 41]. Ponadto wykazano, że miR-21 zmniejsza rozmiar zawału i wczesną przebudowę lewej komory (LV) po IRI u szczurów. Przeciwnie, miR-208 wywiera szkodliwy wpływ poprzez indukcję hipertrofii i niekorzystnej przebudowy. MiRNA surowicy uzyskuje się z próbek przy użyciu zestawu NucleoSpin miRNA Plasma Kit (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Duren, Niemcy) zgodnie z instrukcjami producenta. Wzory ekspresji testowanych miRNA i genu metabolizmu podstawowego, U6sn, oceniono ilościowo przy użyciu odwrotnej transkrypcji i reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą w czasie rzeczywistym (RT-PCR). Komplementarne DNA z pętlą pnia (cDNA) syntetyzuje się przy użyciu zapętlonych starterów do odwrotnej transkrypcji specyficznych dla każdego miRNA. Odwrotną transkrypcję i oznaczenie ilościowe przeprowadza się za pomocą zestawu Mir-X™ MicroRNA Quantification Kit (Clontech Laboratories, USA) zgodnie z instrukcją producenta, stosując Roche Light Cycler Fluorescence Quantitative PCR System (ABI, USA). Wszystkie próbki amplifikowano w trzech powtórzeniach, a każdy eksperyment powtórzono trzy razy w celu potwierdzenia odtwarzalności. Krotność zmiany poziomu ekspresji oblicza się metodą 2-ΔΔCt. Startery do PCR to:

Nazwa Sekwencja miR-150 F: 5'-TCTCCCAACCCTTGTACCAGT- 3' R: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3' miR-208 F: 5'-CTTTTGGCCCGGGTTATAC-3' R: 5'-CTGACATCCTCTAGGCTGG-3' miR-144 F: 5 '-GGGGGTACAGTATAGATGAT-3' R: 5'-TGCGTGTCGTGGAGTC-3' miR-499 F: 5'-CAAAGTCTTCACTTCCCTGCCA-3' R: 5'-GATGTTTAACTCCTCTCCACGTGATC-3' miR-21 F: 5'-CCCGCCTAGCTTATCAGACTG-3' R: 5'-GCCGTCGGTGTCAACATCA-3' miR-145 F: 5'-GGCGTCCAGTTTTCCCAG-3' R: 5'-CAGTGCTGGGTCCGAGTGA-3' U6sn F: 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3' R: 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3' ostatnio wykazano, że obojętne produkty uboczne metabolizmu NO, azotan (NO¬3-) i azotyn (NO2-), działają jako substraty recyklingu w procesie regeneracji NO, który jest niezależny od klasycznej syntazy L-argininy-NO (NOS). Ma to szczególne znaczenie w przypadku niedokrwienia mięśnia sercowego, ponieważ ta ostatnia kaskada jest stopniowo dezaktywowana w warunkach niedotlenienia. Zatem pulę azotanowo-azotynową (NOx) należy postrzegać jako rezerwuar bioaktywności NO, który uzupełnia NOS w stanach niskiego napięcia tlenu. Stężenie azotanów/azotynów w osoczu krwi określa się stosując reakcję Griessa z dostępnym w handlu zestawem (Cayman's Nitrate/Nitrit Colorimetric Assay Kit 780001), jak opisano wcześniej. Każda próbka osocza jest poddawana ultrafiltracji przez filtr odcinający masę cząsteczkową 10 kDa (urządzenie wirówkowe Pall Nanosep® z membraną Omega, Sigma Aldrich: Z722065). Filtry są wstępnie płukane ultraczystą wodą przed ultrafiltracją plazmy. Następnie 500 μl osocza wiruje się przez 30 minut przy 14 000 xg w temperaturze 4°C. Do oznaczenia azotanów/azotynów użyto 40 μl przesączu, dodano odczynniki Griessa i zmierzono absorbancję każdego dołka przy 540 nm za pomocą czytnika serii Infinite 200 PRO (Tecan). Stężenie azotanów/azotynów oznacza się za pomocą krzywej wzorcowej azotanów/azotynów, odpowiednio, przy użyciu Graph Pad prism wersja 7 (Graph Pad Software, Inc.) zgodnie z instrukcjami producenta. Wyniki wyrażono w μmol/l.

Ponadto badacze zamierzają przeprowadzić badanie echokardiograficzne po 1 i 2 latach od rekrutacji w celu zbadania, czy funkcja lewej komory różni się między 3 ramionami badania (2 protokoły RIC i brak interwencji).

Do analizy danych wykorzystywane są programy STATA v.11 i SPSS v.22. Test Shapiro-Wilka służy do sprawdzania, czy dane mają rozkład normalny, natomiast test Levene'a służy do badania homoskedastyczności danych. Wszystkie zmienne nieparametryczne są porównywane za pomocą testu Wilcoxona w celu porównania wartości wyjściowych i po interwencji i są przekształcane w rangi do analizy wielowymiarowej. We wszystkich analizach naukowcy stosują testy dwustronne z p<0,05. Badacze wykorzystują parametryczne (r Pearsona) i nieparametryczne (rho Spearmana) współczynniki korelacji do zbadania powiązań przekrojowych. Analiza wariancji (ANOVA) dla danych klinicznych i biologicznych jest przeprowadzana w celu zbadania różnic między grupami, a wszystkie zmienne nieparametryczne są przekształcane w rangi przed wejściem do analizy przy użyciu wcześniej opublikowanej metodologii. ANOVA (ogólny model liniowy, SPSS 22, SPSS Inc, Chicago, III) dla powtarzanych pomiarów jest stosowana do (a) pomiarów badanej funkcji naczyń i markerów biochemicznych (w T0, T1, T2 i T3 dla pierwszego i na linii podstawowej i zakończenie protokołu dla tego ostatniego) z parametrem czasu używanym jako czynnik wewnątrzobiektowy, oraz (b) przetestowanie różnic między 2 protokołami RIPost (pojedyncza i podwójna inflacja) i procedurą pozorowaną przy użyciu modelu uwzględniającego wiek, płeć, BMI, dyslipidemia, cukrzyca, nadciśnienie tętnicze, współistniejące terapie medyczne, lokalizacja zawału mięśnia sercowego, enzymy mięśnia sercowego i liczba chorych naczyń wieńcowych (zwężenie >70%) jako współzmienne. Badana jest również interakcja między badanymi grupami a zmiennymi towarzyszącymi zawartymi w modelu, a także obliczane są wartości F i p interakcji między czasem pomiaru badanych markerów a badanymi grupami. Korekta Greenhouse'a-Geissera jest stosowana, gdy założenie sferyczności, ocenione testem Mauchly'ego, nie jest spełnione. Porównania post hoc przeprowadza się z poprawką Bonferroniego. Wartość p <0,05 uważa się za istotną statystycznie. Zmienność między- i wewnątrzobserwacyjną (%) markerów naczyniowych i biochemicznych oblicza się jako SD różnic między pierwszym a drugim pomiarem i wyraża jako procent średniej wartości u 30 zdrowych ochotników.