De akutte og kroniske virkninger af fjern iskæmisk konditionering på kardiovaskulær funktion

Denne undersøgelse er et prospektivt, randomiseret forsøg udført på Anden Universitetsafdeling for Kardiologi på Attikon Universitetshospital. To hundrede og halvfjerds patienter med STEMI inden for 48 timer efter primær PCI er randomiseret i to fjernbehandlingsprotokoller (RIC) eller ingen anden intervention end standardbehandling (kontrolgruppe). Den første protokol anvender to iskæmiske stimuli ved oppustning af armmanchet af begge arme ved 200 mmHg i 5 minutter, adskilt med 15 minutter, efter en baseline vaskulær funktionsvurdering (T0). Hver iskæmisk stimulus efterfølges af en vaskulær funktionsvurdering (T1, T2), med en endelig vurdering 25 minutter efter den anden manchettømning (T3). Den anden protokol er identisk med den første, bortset fra udeladelsen af ​​den anden iskæmiske stimulus. Begge protokoller er forudgået af en simuleret konditioneringsprocedure i form af udeladelse af manchetoppustning efter deres placering omkring den almindelige brachiale position. RIC-protokollen vil også blive udført hos 30 raske frivillige. Blodprøver udtages ved baseline (T0) og ved afslutningen af ​​hver protokol (T3). Alle patienter er i sinusrytme, mens eksklusionskriterier inkluderer Killip klasse>2 under indekshændelsen, administration af nitrater, tidligere kendt koronararterie eller anden kardiovaskulær sygdom, tidligere PCI eller koronararterie-bypass-kirurgi (CABG) samt kronisk inflammatorisk og systemisk sygdom. Endvidere vil efterforskerne udføre en to-årig opfølgning for at vurdere a) ændringer i venstre ventrikulær kontraktilitet via estimering af venstre ventrikulær ende systolisk volumen (LVESV) ved ekkokardiografi undersøgelse b) ændringer i endotel glycocalyx og arteriel stivhed.

Arteriel stivhed vurderes ved carotis-femoral pulsbølgehastighed (PWV) ved hjælp af arteriel tonometri (Complior, Alam Medical, Vincennes, Frankrig); normale værdier <10 m/s. PWV beregnes som afstanden mellem carotis og femoral arteriel pulspalpation, divideret med transittiden mellem bølger (m/s). Alle målinger udføres af den samme undersøger, som er blind for den iskæmiske protokol, der udnyttes (intra-observatør variabilitet=5%).

Perfusionsgrænseregionen (PBR) af sublingual arteriel mikrovaskulatur (diameterspænd fra 5 til 25 μm) måles ved hjælp af Sidestream Darkfield-billeddannelse (Microscan, Glycocheck, Microvascular Health Solutions Inc., Salt Lake City, UT, USA). PBR er det cellefattige lag, der er et resultat af faseadskillelsen mellem de strømmende røde blodlegemer (RBC) og plasma på mikrokarrets luminale overflade. PBR inkluderer den komponent af glycocalyx, der tillader cellepenetration. Således er en øget perfunderet grænseregion (PBR) i overensstemmelse med dybere penetration af erytrocytter i glycocalyx, hvilket indikerer et tab af glycocalyx-barriereegenskaber og er en markør for reduceret glycocalyx-tykkelse. Dette udgør en standardiseret, reproducerbar, operatøruafhængig metode til vurdering af arteriel glycocalyx og foreslås således som et middel til evaluering af endotelintegritet.

Malondialdehyd (MDA) bestemmes spektrofotometrisk med et kommercielt sæt (Oxford Biomedical Research, Rochester Hills, Mich, kolorimetrisk assay for lipidperoxidation; måleområde 1-20 nmol/L; henholdsvis 3,39 % og 4,75 % intra-assay og inter-assay variabilitet ). IL-6 måles ved et højfølsomt immunassay [humant IL-6 kvantikinin (høj følsomhed)], der detekterer værdier så lave som 0,094 (intra-assay variabilitet <5%).

MikroRNA'er (Mirs) er små, enkeltstrengede, ikke-kodende RNA-molekyler, der omfatter 19-25 nukleotider, som regulerer post-transkriptionel genekspression som reaktion på cellulære eller miljømæssige stimuli [38]. Deres ikke-invasivitet og stabilitet i serum muliggør hurtig estimering af deres ekspression ved hjælp af arkiverede serumprøver. Specifikke MiR'er er blevet impliceret i patogenesen af ​​kardiovaskulær sygdom og IRI. MiR-144 fungerer som en pivotal RIC-mediator, mens miR-150 og miR-499 hæmmer apoptose og fibrose i dyremodeller af myokardie-IRI [40, 41]. Derudover er miR-21 blevet påvist at reducere infarktstørrelsen og tidlig venstre ventrikulær (LV) ombygning efter IRI hos rotter. Tværtimod udøver miR-208 skadelige virkninger i form af hypertrofi og uønsket ombygningsinduktion. Serum miRNA opnås fra prøver ved hjælp af NucleoSpin miRNA Plasma Kit (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Duren, Tyskland) i henhold til instruktionerne fra producenten. Ekspressionsmønstrene for de testede miRNA'er og et husholdningsgen, U6sn, blev kvantitativt analyseret ved hjælp af revers transkription og real-time revers transcriptase polymerase kædereaktion (RT-PCR). Stam-loop komplementære DNA'er (cDNA'er) syntetiseres ved hjælp af looped revers transcription primere specifikke for hver miRNA. Omvendt transkription og kvantificering udføres med Mir-X™ MicroRNA Quantification Kit (Clontech Laboratories, USA) i henhold til instruktionerne fra producenten ved brug af Roche Light Cycler Fluorescence Quantitative PCR System (ABI, USA). Alle prøverne amplificeres i tre eksemplarer, og hvert forsøg blev gentaget tre gange for at bekræfte reproducerbarheden. Foldeændringen i ekspressionsniveau beregnes ved hjælp af 2-ΔΔCt-metoden. Primerne til PCR er:

Navnesekvens miR-150 F: 5'-TCTCCAACCCTTGTACCAGT- 3' R: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3' miR-208 F: 5'-CTTTTTGGCCCGGGTTATAC-3' R: 5'-CTGACATCCTCTAGGCTGG-144' F miR:-5'-CTGACATCCTCTAGGCTGG-144' '-GGGGGTACAGTATAGATGAT-3' R: 5'-TGCGTGTCGTGGAGTC-3' miR-499 F: 5'-CAAAGTCTTCACTTCCCTGCCA-3' R: 5'-GATGTTTAACTCCTCTCCACGTGATC-3' miR-21 F: 5'-CCAGACTCCTAG-CTTA 5'-GCCGTCGGTGTCAACATCA-3' miR-145 F: 5'-GGCGTCCAGTTTTCCCAG-3' R: 5'-CAGTGCTGGGTCCGAGTGA-3' U6sn F: 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3' R: 5'-AACGGT-3'ATTTGC En gang betragtet som inerte biprodukter af NO-metabolisme, nitrat (NO¬3-) og nitrit (NO2-) har for nylig vist sig at fungere som genbrugssubstrater i en NO-regenereringsproces, som er uafhængig af den klassiske L-arginin-NO-syntase (NOS) vej. Dette er af særlig betydning i forbindelse med myokardieiskæmi, da sidstnævnte kaskade gradvist deaktiveres i hypoxiske miljøer. Nitrat-nitrit (NOx)-puljen bør således opfattes som et reservoir af NO-bioaktivitet, der komplementerer NOS i tilstande med lavt iltspænding. Koncentrationen af ​​nitrat/nitrit i blodplasma bestemmes ved hjælp af Griess-reaktion med et kommercielt tilgængeligt kit (Cayman's Nitrat/Nitrit Kolorimetrisk Assay Kit 780001), som vi har beskrevet tidligere. Hver plasmaprøve ultrafiltreres gennem et 10 kDa molekylvægt cut-off filter (Pall Nanosep® centrifugalenhed med Omega membran, Sigma Aldrich: Z722065). Filtrene forskylles med ultrarent vand før ultrafiltrering af plasmaet. Derefter centrifugeres 500μL plasma i 30 minutter ved 14.000xg ved 4°C. 40μL af filtratet bruges til bestemmelse af nitrat/nitrit, Griess-reagenserne tilsættes, og absorbansen af ​​hver brønd blev målt ved 540nm ved hjælp af læseren Infinite 200 PRO-serien (Tecan). Koncentrationen af ​​nitrat/nitrit bestemmes med henholdsvis en nitrat/nitrit-standardkurve ved hjælp af Graph Pad prisme version 7 (Graph Pad Software, Inc.) i henhold til producentens instruktioner. Resultaterne er udtrykt i μmol/L.

Desuden vil efterforskerne udføre en ekkokardiografisk undersøgelse 1 og 2 år efter rekrutteringen for at undersøge, om den venstre ventrikulære funktion adskiller sig blandt de 3 arme af undersøgelsen (2 RIC-protokoller og ingen intervention).

STATA v.11 og SPSS v.22 bruges til at analysere dataene. Shapiro-Wilk testen bruges til at undersøge om dataene er normalfordelte, hvorimod Levene testen bruges til at undersøge dataenes homoskedasticitet. Alle ikke-parametriske variabler sammenlignes ved hjælp af Wilcoxon-testen til sammenligninger mellem baseline- og post-interventionsværdier og transformeres til rækker til multivariat analyse. I alle analyser bruger forskerne to hale-test med p<0,05. Efterforskerne bruger parametriske (Pearson r) og ikke-parametriske (Spearman rho) korrelationskoefficienter til at undersøge tværsnitssammenhænge. Variansanalyse (ANOVA) for kliniske og biologiske data udføres for at teste forskellene mellem grupper, og alle ikke-parametriske variabler transformeres til rækker, før de går ind i analysen ved hjælp af en tidligere offentliggjort metode. ANOVA (generel lineær model, SPSS 22, SPSS Inc, Chicago, Ill) til gentagne målinger anvendes til (a) målinger af den undersøgte vaskulære funktion og biokemiske markører (ved T0, T1, T2 og T3 for førstnævnte og ved baseline og opsigelse af protokol for sidstnævnte) med parameteren tid brugt som en inden for-subjekt-faktor, og (b) for at teste forskelle mellem de 2 RIPost-protokoller (enkelt- versus dobbelt-inflation) og falsk procedure ved hjælp af en model inklusive alder, køn, BMI, dyslipidæmi, diabetes, hypertension, samtidige medicinske behandlinger, MI-lokation, myokardieenzymer og antallet af syge koronarkar (>70 % stenose) som kovariater. Samspillet mellem undersøgelsesgrupperne og de kovariater, der indgår i modellen, undersøges også, mens F- og p-værdierne for samspillet mellem måletidspunkt for de undersøgte markører og undersøgelsesgrupper også beregnes. Drivhus-Geisser-korrektionen bruges, når antagelsen om sfæricitet, som vurderet ved Mauchlys test, ikke er opfyldt. Post hoc sammenligninger udføres med Bonferroni korrektion. En p-værdi på <0,05 anses for at være statistisk signifikant. Inter- og intra-observatørvariabiliteter (%) af vaskulære og biokemiske markører beregnes som SD af forskellene mellem den første og anden måling og er udtrykt som en procentdel af gennemsnitsværdien hos 30 raske frivillige.