De akutte og kroniske effektene av fjern iskemisk kondisjonering på kardiovaskulær funksjon

Denne studien er en prospektiv, randomisert studie utført ved andre universitetsavdeling for kardiologi i Attikon universitetssykehus. To hundre og sytti pasienter med STEMI, innen 48 timer etter primær PCI, er randomisert i to fjernbehandlingsprotokoller (RIC) eller ingen intervensjon annet enn standardbehandling (kontrollgruppe). Den første protokollen bruker to iskemiske stimuli ved oppblåsing av armmansjetten av begge armer ved 200 mmHg i 5 minutter, atskilt med 15 minutter, etter en baseline vaskulær funksjonsvurdering (T0). Hver iskemisk stimulus etterfølges av en vaskulær funksjonsvurdering (T1, T2), med en endelig vurdering 25 minutter etter andre mansjetttømming (T3). Den andre protokollen er identisk med den første, bortsett fra utelatelsen av den andre iskemiske stimulansen. Begge protokollene innledes med en sham condition-prosedyre, i form av utelatelse av mansjettoppblåsing etter at de er plassert rundt den vanlige brachiale posisjonen. RIC-protokollen vil også bli utført hos 30 friske frivillige. Blodprøver tas ved baseline (T0) og ved avslutning av hver protokoll (T3). Alle pasienter er i sinusrytme, mens eksklusjonskriterier inkluderer Killip klasse>2 under indekshendelsen, administrering av nitrater, tidligere kjent koronararterie eller annen kardiovaskulær sykdom, tidligere PCI eller koronararterie-bypass-kirurgi (CABG), samt kronisk inflammatorisk og systemisk sykdom. Videre skal etterforskerne gjennomføre en to-års oppfølging for å vurdere a) endringer i venstre ventrikkel kontraktilitet via estimering av venstre ventrikkel ende systolisk volum (LVESV) ved ekkokardiografi studie b) endringer i endotel glykokalyx og arteriell stivhet.

Arteriell stivhet vurderes ved carotis-femoral pulsbølgehastighet (PWV) ved bruk av arteriell tonometri (Complior, Alam Medical, Vincennes, Frankrike); normale verdier <10 m/s. PWV beregnes som avstanden mellom palpasjonsstedet for carotis og femoral arteriell puls, delt på transitttiden mellom bølgene (m/s). Alle målinger utføres av samme undersøker, som er blind for den iskemiske protokollen som er utnyttet (intra-observatørvariabilitet=5%).

Perfusjonsgrenseområdet (PBR) av sublingual arteriell mikrovaskulatur (diameterspenn fra 5 til 25 μm) måles ved bruk av Sidestream Darkfield-avbildning (Microscan, Glycocheck, Microvascular Health Solutions Inc., Salt Lake City, UT, USA). PBR er det cellefattige laget, et resultat av faseseparasjonen mellom de flytende røde blodcellene (RBC) og plasma på mikrokarets luminale overflate. PBR inkluderer komponenten av glycocalyx som tillater cellepenetrering. Således er en økt perfusert grenseregion (PBR) i samsvar med dypere penetrasjon av erytrocytter inn i glykokalyx, noe som indikerer tap av glykokalyksbarriereegenskaper og er en markør for redusert glykokalykstykkelse. Dette utgjør en standardisert, reproduserbar, operatøruavhengig metode for å vurdere arteriell glykokalyx, og er derfor foreslått som et middel til evaluering av endotelintegritet.

Malondialdehyd (MDA) bestemmes spektrofotometrisk med et kommersielt sett (Oxford Biomedical Research, Rochester Hills, Mich, kolorimetrisk analyse for lipidperoksidasjon; måleområde 1-20 nmol/L; henholdsvis 3,39 % og 4,75 % intra-analyse og inter-assay variasjon ). IL-6 måles ved en høysensitiv immunanalyse [humant IL-6 kvantikinin (høy sensitivitet)], som oppdager verdier så lave som 0,094 (intra-analyse variasjon <5 %).

MikroRNA (Mirs) er små, enkelttrådet, ikke-kodende RNA-molekyler som omfatter 19-25 nukleotider som regulerer post-transkripsjonelt genuttrykk som respons på cellulære eller miljømessige stimuli [38]. Deres ikke-invasivitet og stabilitet i serum tillater rask estimering av deres uttrykk ved bruk av arkiverte serumprøver. Spesifikke MiR-er har vært involvert i patogenesen av hjerte- og karsykdommer og IRI. MiR-144 fungerer som en sentral RIC-mediator, mens miR-150 og miR-499 hemmer apoptose og fibrose i dyremodeller av myokardial IRI [40, 41]. I tillegg har miR-21 blitt vist å redusere infarktstørrelsen og tidlig venstre ventrikkel (LV) ombygging etter IRI hos rotter. Tvert imot, miR-208 utøver skadelige effekter ved hjelp av hypertrofi og uønsket remodelleringsinduksjon. Serum miRNA er hentet fra prøver ved bruk av NucleoSpin miRNA Plasma Kit (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Duren, Tyskland) i henhold til instruksjonene fra produsenten. Ekspresjonsmønstrene til de testede miRNA-ene og et husholdningsgen, U6sn, ble kvantitativt analysert ved bruk av revers transkripsjon og sanntids revers transkriptase-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR). Stem-loop komplementære DNA (cDNA) syntetiseres ved å bruke looped revers transkripsjonsprimere spesifikke for hver miRNA. Omvendt transkripsjon og kvantifisering utføres med Mir-X™ MicroRNA Quantification Kit (Clontech Laboratories, USA) i henhold til instruksjonene fra produsenten som bruker Roche Light Cycler Fluorescence Quantitative PCR System (ABI, USA). Alle prøvene blir amplifisert i tre eksemplarer, og hvert eksperiment ble gjentatt tre ganger for å bekrefte reproduserbarhet. Foldeendringen i ekspresjonsnivå beregnes ved å bruke 2-ΔΔCt-metoden. Primerne for PCR er:

Navnesekvens miR-150 F: 5'-TCTCCCAACCCTTGTACCAGT- 3' R: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3' miR-208 F: 5'-CTTTTTGGCCCGGGTTATAC-3' R: 5'-CTGACATCCTCTAGGCTGG-144' F miR:- '-GGGGGTACAGTATAGATGAT-3' R: 5'-TGCGTGTCGTGGAGTC-3' miR-499 F: 5'-CAAAGTCTTCACTTCCCTGCCA-3' R: 5'-GATGTTTAACTCCTCTCCACGTGATC-3' miR-21 F: 5'-CCAGACTCCTAG-CTTA 5'-GCCGTCGGTGTCAACATCA-3' miR-145 F: 5'-GGCGTCCAGTTTTCCCAG-3' R: 5'-CAGTGCTGGGTCCGAGTGA-3' U6sn F: 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3' R: 5'-AACGGTCTTCACGAATTTG en gang ansett som inerte biprodukter av NO-metabolisme, nitrat (NO¬3-) og nitritt (NO2-) har nylig vist seg å fungere som resirkuleringssubstrater i en prosess med NO-regenerering, som er uavhengig av den klassiske L-arginin-NO-syntasen (NOS) vei. Dette er spesielt viktig i forbindelse med myokardiskemi, ettersom sistnevnte kaskade gradvis deaktiveres i hypoksiske miljøer. Dermed bør nitrat-nitritt (NOx) bassenget oppfattes som et reservoar av NO bioaktivitet som komplementerer NOS i tilstander med lavt oksygenspenning. Konsentrasjonen av nitrat/nitritt i blodplasma bestemmes ved å bruke Griess-reaksjon med et kommersielt tilgjengelig sett (Cayman's Nitrat/Nitrite Colorimetric Assay Kit 780001) som vi har beskrevet tidligere. Hver plasmaprøve ultrafiltreres gjennom et 10 kDa molekylvektsavskjæringsfilter (Pall Nanosep® sentrifugalenhet med Omega-membran, Sigma Aldrich: Z722065). Filtrene forskylles med ultrarent vann før ultrafiltrering av plasmaet. Deretter sentrifugeres 500 μL plasma i 30 minutter ved 14 000 xg ved 4°C. 40μL av filtratet brukes til bestemmelse av nitrat/nitritt, Griess-reagensene tilsettes og absorbansen til hver brønn ble målt ved 540nm ved å bruke avleseren Infinite 200 PRO-serien (Tecan). Konsentrasjonen av nitrat/nitritt bestemmes med en nitrat/nitritt-standardkurve henholdsvis ved bruk av Graph Pad prisme versjon 7 (Graph Pad Software, Inc.) i henhold til produsentens instruksjoner. Resultatene er uttrykt i μmol/L.

Videre skal etterforskerne utføre en ekkokardiografisk studie 1 og 2 år etter rekrutteringen for å undersøke om venstre ventrikkelfunksjon er forskjellig mellom de 3 armene av studien (2 RIC-protokoller og ingen intervensjon).

STATA v.11 og SPSS v.22 brukes til å analysere dataene. Shapiro-Wilk-testen brukes til å undersøke om dataene er normalfordelte, mens Levene-testen brukes til å undersøke homoskedastisiteten til dataene. Alle ikke-parametriske variabler sammenlignes ved hjelp av Wilcoxon-testen for sammenligninger mellom baseline- og post-intervensjonsverdier og transformeres til rangeringer for multivariat analyse. I alle analyser bruker forskerne to tailed tester med p<0,05. Etterforskerne bruker parametriske (Pearson r) og ikke-parametriske (Spearman rho) korrelasjonskoeffisienter for å undersøke tverrsnittsassosiasjoner. Variansanalyse (ANOVA) for kliniske og biologiske data utføres for å teste forskjellene mellom grupper, og alle ikke-parametriske variabler transformeres til rangeringer før de går inn i analysen ved hjelp av en tidligere publisert metodikk. ANOVA (generell lineær modell, SPSS 22, SPSS Inc, Chicago, Ill) for gjentatte målinger brukes for (a) målinger av den undersøkte vaskulære funksjonen og biokjemiske markører (ved T0, T1, T2 og T3 for førstnevnte og ved baseline og avslutning av protokollen for sistnevnte) med tidsparameteren brukt som en innen-subjekt-faktor, og (b) for å teste forskjeller mellom de 2 RIPost-protokollene (enkelt versus dobbel inflasjon) og falsk prosedyre ved bruk av en modell som inkluderer alder, kjønn, BMI, dyslipidemi, diabetes, hypertensjon, samtidige medisinske behandlinger, MI-lokalisering, myokardenzymer og antall syke koronarkar (>70 % stenose) som kovariater. Samspillet mellom studiegruppene og kovariatene som inngår i modellen undersøkes også, mens F- og p-verdiene for interaksjonen mellom måletidspunkt for de undersøkte markørene og studiegruppene også beregnes. Drivhus-Geisser-korreksjonen brukes når sfærisitetsantagelsen, som vurdert av Mauchlys test, ikke er oppfylt. Post hoc-sammenligninger utføres med Bonferroni-korreksjon. En p-verdi på <0,05 anses som statistisk signifikant. Inter- og intra-observatørvariabiliteter (%) av vaskulære og biokjemiske markører beregnes som SD av forskjellene mellom den første og andre målingen, og uttrykkes som en prosentandel av gjennomsnittsverdien hos 30 friske frivillige.