ヒト白色脂肪組織のUCP1遺伝子に対する慢性運動の影響

研究者らは、3 つの異なる 8 週間の運動プログラム [有酸素運動 (参加者 9 人)、レジスタンス (参加者 8 人)、組み合わせ (有酸素運動とレジスタンス) 、8人の参加者）]および非運動グループ（7人の参加者）、その後8週間のトレーニング解除期間. 運動強度は、運動期間を通じて最大酸素消費量 (VO2peak) の 65%、最大 1 反復 (1RM) に設定されました。ヒト白色脂肪組織 (WAT)。 ギリシャ、テッサリアのトリカラにある 3 つの地元のジムで、参加者間の相互汚染を避けるために各エクササイズ グループごとにエクササイズが行われましたが、エクササイズの監督者は研究の目的を知らされていませんでした。 人体測定、体組成、安静時エネルギー消費量 (REE)、および皮下脂肪生検の測定値は、ベースライン、運動後 (8 週目) およびトレーニング終了後 (16 週目) の期間に取得され、食事データは平日 2 日間無作為に収集され、ベースラインでの週末の 1 日、8 週目と 16 週目。 VO2peak と 1RM は、ベースライン、4 週目 (必要な運動強度を 65% に調整するため)、8 週目、16 週目に測定されました。

人体測定 参加者は午前 7:00 から午前 9:00 の間に研究所を訪れ、以下の人体測定測定に参加しました: 身長は Seca (ドイツ、ハンブルグ) の装置を使用して測定し、体重は体重計 (KERN & Sohn GmbH、バージョン 5.3、ドイツ) を使用して測定しました。 ）一方、アネロイド血圧計を使用した音響法により、巻き尺と血圧を使用してウエストとヒップの比率を測定しました。 体脂肪率および無脂肪量は、体組成モニター (Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA D-61346 Bad Hamburg, Germany) を使用して、生体電気インピーダンスによって測定されました。

脂肪生検 すべての生検は、非ジアテルミー法による以前の方法論に従って、経験豊富な外科医によって実行されました。 参加者は、少なくとも8時間の絶食後に皮下脂肪生検を受け、誤解を招く結果のリスクを最小限に抑えるために、生検手順の72時間前に運動、アルコール、受動喫煙を控えるように指示されました. 各参加者は仰臥位で外科用ベッドに配置されました。 切開部位を消毒し、10mlのキシロカイン2%-アドレナリンなしを局所麻酔のために切開部位に注射した。 脂肪組織が露出するまでの皮膚および皮下組織の切開は、へその近くで約 3 ～ 5 センチメートル実行され、切開の長さは約 2 ～ 2.5 センチメートルでした。 続いて、手術用ハサミで皮下組織を除去し、脂肪組織が見えるようになった時点で、約500ミリグラムの脂肪組織を捕捉して除去した。 採取した脂肪組織は、直ちに摂氏-190度の液体窒素に浸した。 最終沈着のために、サンプルをエッペンドルフに置き、分析まで-80℃の冷凍庫に沈着させた。

UCP1 mRNA 分析 遺伝子およびタンパク質発現分析を行った研究者は、研究の目的を知らされていませんでした。 製造元のプロトコルに従って、ＲＮｅａｓｙ Ｌｉｐｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して脂肪組織生検から全ＲＮＡを抽出した。 ランダムプライマーとM-MLV逆転写酵素（Promega）を使用して、等量の全RNAからファーストストランドcDNAを合成しました。 UCP1 遺伝子の定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応は、Sybr Green フルオロフォアを使用して実行されました。 各サイクルでの蛍光の変化を監視し、各反応のバックグラウンドを超える閾値サイクルを計算しました。 融解曲線分析は、すべての実行後に実行され、すべての反応で単一の増幅産物が確実に得られるようにしました。 すべての反応は、サンプルごとに少なくとも2回実行されました。 18S rRNA 遺伝子は、すべての実験条件下で常に発現し、この遺伝子が UCP1 mRNA の正規化に最も適した遺伝子として示唆されたため、正規化の参照遺伝子として使用されました。

UCP1 タンパク質分析 皮下脂肪組織を、プロテアーゼ阻害剤 (Sigma-Aldrich、ミラノ、イタリア) を含む RIPA Lysis Buffer でホモジナイズし、摂氏 4 度で 800 g で 10 分間遠心分離し、中間層を回収しました。 等量 (50 マイクログラム) のタンパク質を 10% SDS-ポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロース膜に転写しました。 皮下脂肪組織サンプルからのUCP1は、一次抗体、それぞれウサギポリクローナル抗ヒトUCP1（1：1000、Sigma-Aldrich、Milan、Italy）およびマウスモノクローナル抗ヒトβ-アクチン（1：5000、Sigma-Aldrich、ミラノ、イタリア）。 二次抗体は、UCP1 に対するペルオキシダーゼ結合抗ウサギ IgG と、β-アクチンに対する抗マウス IgG でした。 以前の方法論に従って、100uM メントールで処理したヒト脂肪細胞を UCP1 タンパク質発現の陽性対照として使用しました。 ウエスタンブロッティング分析は、Immobilion Western ChemiluminumHRP Substrate (Millipore) を使用して行い、検出は写真フィルムを使用して行いました。 画像は、タンパク質染色の相対量を評価し、光学密度の観点から結果を定量化するデンシトメトリーによって分析されています。

REE 評価 REE 評価は、12 時間の絶食後、午前 7:00 から午前 9:00 の間に実施されましたが、参加者は測定の 72 時間前から運動、アルコール、受動喫煙を控えていました。 REE は、参加者に取り付けられた自動ガス分析装置 (Vmax、CareFusion、米国) を使用して測定され、摂氏 22 ～ 24 度の静かな部屋で 30 分間仰臥位で 20 秒ごとに呼吸変数を記録しました。 収集された 30 分間のデータから、最初と最後の 5 分間が削除されました。 最後に、収集されたデータの残りの 20 分間を平均して、最終的な REE (カロリー) 値を取得しました。 呼吸ガス測定値は、ウィアーの式を使用して抽出し、VO2 および VCO2 値を REE (カロリー) 値に変換しました。 REE測定の精度を確保するために、平均呼吸交換比も以前の方法論に従って検証されました。

VO2peak および 1RM の評価 ベースラインで、各参加者の事前スクリーニングを実施し、身体活動準備アンケートを使用して VO2peak テストを実施する資格があるかどうかを確認しました。 参加者がVO2peakテストに慣れるようにするために、プロトコルの詳細な口頭説明が事前に提供されました。 プロトコルには、5 分間のウォームアップと、Monark Ergomedic 839E、Vansbro、Sweden でのサイクリングの習熟期間が含まれていました。 その結果、このテストでは、60 ワットで毎分 60 回転で 3 分間ペダリングし、その後、意欲的に消耗するまで毎分 30 ワットずつ増加させました。 自動ガス分析装置 (Vmax、CareFusion、米国) を参加者に取り付けて、20 秒ごとに呼吸変数を記録しました。 任意の 20 秒間の最大酸素摂取量 (ミリリットル/分) を最終的な VO2peak 値として記録しました。

1RM のレッグ エクステンションとチェスト プレスは、次のようにテストされました。 次に、繰り返し回数を計算し、各参加者が持ち上げたキログラム単位の重量と実行された繰り返し回数を使用して、ノルムを使用して 1RM を予測しました。

食事の評価 参加者は、3 日間の食事記録を完了するために、1 週間のうちの 3 日間 (平日 2 日、週末 1 日) に、研究の目的を知らされていない独立したアシスタントから電話で無作為に連絡を受けました。 接触日に消費されたすべての飲食物が記録されました。 3 日間の食事記録は、介入のベースライン、8 週目、16 週目に収集されました。 すべての食事記録は、Nutritionist Pro バージョン 5.4.0 を使用して、研究の目的を知らされていない別の訓練を受けたアシスタントによって分析されました。 Axxya Systems (米国ワシントン州レドモンド)。 このソフトウェア（つまり Nutritionist Pro) は、以前は研究目的で使用されていました。 分析のために、消費された各食品と飲料について、Nutritionist Pro で検索が行われました。 各食品および/または飲料の量と準備に関する詳細も含まれていました。 食品または飲料に関するすべての関連情報がソフトウェアに入力されると、マクロおよび微量栄養素含有量の対応するリストが提供され、その後保存されました。 このプロセスは、ダイエット記録に記載されているすべての食品と飲料について繰り返されました。 特定の食品または飲料が Nutritionist Pro データベース内に見つからなかった場合、調査員はその特定の食品の主要栄養素および微量栄養素の含有量を手動で入力し、将来の使用のためにデータベースに保存しました。 各食品または飲料についてソフトウェアによって提供されるフィードバックには、次の食事変数が含まれていました: 総エネルギー摂取量 (カロリー)、食品の重量 (文法)、タンパク質 (文法)、炭水化物 (文法)、総脂肪 (文法)、総糖 (文法) とカフェイン (マイクロ文法)。