Účinky chronického cvičení na gen UCP1 v lidské bílé tukové tkáni

Výzkumníci získali tři (základní, po cvičení, po ukončení tréninku) biopsie podkožního tuku od 32 zdravých mužů, kteří absolvovali tři různé osmitýdenní cvičební programy [aerobní (9 účastníků), odpor (8 účastníků), kombinované (aerobní + odpor , 8 účastníků)] a necvičící skupina (7 účastníků), po které následovalo osmitýdenní období odtrénování. Intenzita cvičení byla stanovena na 65 % maximální spotřeby kyslíku (VO2peak) a 1 maximum opakování (1RM) po celou dobu cvičení, zatímco obsah cvičebních programů založených na předchozí studii, která zkoumala gen PGC1a, o kterém se předpokládá, že zvyšuje UCP1 v lidské bílé tukové tkáni (WAT). Cvičení se provádělo ve třech místních tělocvičnách v Trikala, Thesálie, Řecko, každá pro každou cvičební skupinu, aby se zabránilo křížové kontaminaci mezi účastníky, zatímco vedoucí cvičení byli zaslepeni vůči cíli studie. Měření antropometrie, tělesného složení, klidového energetického výdeje (REE) a biopsie podkožního tuku byla získána na začátku, po cvičení (8. týden) a po ukončení tréninku (16. týden), zatímco údaje o stravě byly náhodně sbírány po dva dny v týdnu a jeden víkendový den na začátku, 8. a 16. týden. VO2peak a 1RM byly měřeny na začátku, 4. (pro úpravu požadované intenzity cvičení na 65 %), 8. a 16. týdnu.

Antropometrie Účastníci navštívili laboratoř mezi 07:00 a 09:00 a účastnili se následujících antropometrických měření: Výška byla měřena pomocí zařízení Seca (Hamburg, Německo) a hmotnost pomocí váhy (KERN & Sohn GmbH, verze 5.3, Německo ), zatímco poměr pasu k bokům byl měřen pomocí metru a krevní tlak akustickou metodou s použitím aneroidního sfygmomanometru. Procento tělesného tuku a beztuková hmota byla měřena pomocí bioelektrické impedance za použití monitoru tělesného složení (Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA D-61346 Bad Hamburg, Německo).

Tukové biopsie Všechny biopsie byly provedeny zkušeným chirurgem podle předchozí metodiky nediatermickou metodou. Účastníci podstoupili biopsii podkožního tuku po nejméně osmihodinovém hladovění a byli instruováni, aby se 72 hodin před biopsií zdrželi cvičení, alkoholu a pasivního kouření, aby se minimalizovalo riziko zavádějících výsledků. Každý účastník byl umístěn na chirurgickém lůžku v poloze na zádech. Místo řezu bylo dezinfikováno a do oblasti řezu bylo injikováno 10 ml 2% xylokainu bez adrenalinu pro lokální anestezii. Řez na kůži a podkoží až do odhalení tukové tkáně byl proveden přibližně 3-5 centimetrů poblíž pupku, přičemž délka řezu byla přibližně 2-2,5 centimetru. Následně bylo podkoží odstraněno operačními nůžkami a když se tuková tkáň stala viditelnou, bylo zachyceno a odstraněno téměř 500 miligramů tukové tkáně. Odebraná tuková tkáň byla okamžitě ponořena do kapalného dusíku o teplotě -190 °C. Pro konečnou depozici byly vzorky umístěny do Eppendorfs a byly uloženy v mrazáku při -80 °C až do analýzy.

Analýza UCP1 mRNA Výzkumníci, kteří prováděli analýzy genové a proteinové exprese, byli vůči cíli studie zaslepeni. Celková RNA byla extrahována z biopsií tukové tkáně pomocí mini sady RNeasy Lipid Tissue (QIAGEN) podle protokolu výrobce. První vlákno cDNA bylo syntetizováno ze stejných množství celkové RNA za použití náhodných primerů a M-MLV reverzní transkriptázy (Promega). Kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase pro gen UCP1 byla provedena pomocí fluoroforu Sybr Green. Byla monitorována změna fluorescence v každém cyklu a byl vypočten prahový cyklus nad pozadím pro každou reakci. Po každém běhu byla provedena analýza křivky tání, aby se zajistil jediný amplifikovaný produkt pro každou reakci. Všechny reakce byly provedeny alespoň duplikovaně pro každý vzorek. Gen 18S rRNA byl neustále exprimován za všech experimentálních podmínek a poté byl použit jako referenční gen pro normalizaci, protože tento gen byl navržen jako nejvhodnější pro normalizaci mRNA UCP1.

Analýza proteinu UCP1 Subkutánní tuková tkáň byla homogenizována v RIPA Lysis Buffer s inhibitory proteázy (Sigma-Aldrich, Milán, Itálie), centrifugována při 800 g po dobu 10 minut při 4 °C a poté byla odebrána střední vrstva. Stejná množství (50 mikrogramů) proteinů byla separována na 10% SDS-polyakrylamidovém gelu, přenesena na nitrocelulózovou membránu. UCP1 ze vzorků subkutánní tukové tkáně byly detekovány primárními protilátkami, respektive králičím polyklonálním anti-lidským UCP1 (1:1000, Sigma-Aldrich, Milán, Itálie) a myším monoklonálním anti-lidským β-aktinem (1:5000, Sigma-Aldrich, Milán, Itálie). Sekundární protilátky byly anti-králičí IgG konjugovaný s peroxidázou pro UCP1 a anti-myší IgG pro β-aktin. Lidské adipocyty, které byly ošetřeny 100uM mentolem, byly použity jako pozitivní kontroly pro expresi proteinu UCP1 podle předchozí metodiky. Analýza Western blotting byla provedena pomocí Immobilion Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore) a detekce byla provedena pomocí fotografických filmů. Obrázky byly analyzovány denzitometrií, která vyhodnocuje relativní množství proteinového barvení a kvantifikuje výsledky z hlediska optické hustoty.

Hodnocení REE Hodnocení REE bylo prováděno mezi 07:00 a 09:00 po 12 hodinách půstu, přičemž účastníci se 72 hodin před měřením zdrželi cvičení, alkoholu a pasivního kouření. REE byla měřena pomocí automatického analyzátoru plynů (Vmax, CareFusion, USA), který byl připojen k účastníkům, aby zaznamenával respirační proměnné každých 20 sekund v poloze na zádech po dobu 30 minut v tiché místnosti 22-24 ° Celsia. Z 30 minut shromážděných dat bylo odstraněno prvních a posledních pět minut. Nakonec bylo zbývajících 20 minut shromážděných dat zprůměrováno, aby se získala konečná hodnota REE (kalorie). Měření dýchacích plynů byla extrahována pomocí Weirovy rovnice pro převod hodnot VO2 a VCO2 na hodnoty REE (kalorie). Pro zajištění přesnosti měření REE byl také ověřen průměrný respirační výměnný poměr podle předchozí metodiky.

Hodnocení VO2peak a 1RM Na začátku byl u každého účastníka proveden předběžný screening, aby se zjistila jeho způsobilost k provedení testu VO2peak pomocí dotazníku připravenosti na fyzickou aktivitu. Pro zajištění seznámení účastníků s testem VO2peak byl předem uveden podrobný slovní popis protokolu. Protokol zahrnoval pětiminutové zahřívání a seznámení s jízdou na kole na Monark Ergomedic 839E, Vansbro, Švédsko. V důsledku toho test zahrnoval tříminutové šlapání při 60 otáčkách za minutu při 60 wattech s následným přírůstkem 30 wattů/minutu až do dobrovolného vyčerpání. K účastníkům byl připojen automatický analyzátor plynů (Vmax, CareFusion, USA), který každých 20 sekund zaznamenával respirační proměnné. Nejvyšší spotřeba kyslíku (mililitry/minutu) pro jakýkoli 20sekundový interval byla zaznamenána jako konečná hodnota VO2peak.

1RM extenze nohou a tlak na hrudník byly testovány následovně: Pro každého účastníka byla upravena vhodná váha tak, aby ji nebyl schopen zvednout maximálně 10 opakování. Poté byl vypočten počet opakování a byla použita norma k předpovědi 1RM pomocí hmotnosti v kilogramech, kterou každý účastník zvedl, a počtu opakování, která byla provedena.

Hodnocení stravy Účastníci byli náhodně kontaktováni telefonicky - nezávislým asistentem, který byl zaslepený vůči cíli studie - ve třech oddělených dnech (dva pracovní dny, jeden víkendový den) během týdenního období za účelem dokončení třídenního dietního záznamu. Všechny potraviny a nápoje zkonzumované v den kontaktu byly zaznamenány. Třídenní dietní záznamy byly shromážděny na začátku, v 8. a 16. týdnu intervence. Všechny dietní záznamy byly analyzovány dalším vyškoleným asistentem, který byl zaslepený k cíli studie pomocí Nutritionist Pro, verze 5.4.0, Axxya Systems (Redmond, WA, USA). Tento software (tj. Nutritionist Pro) byl dříve používán pro výzkumné účely. Pro analýzu bylo provedeno vyhledávání v aplikaci Nutritionist Pro pro každé zkonzumované jídlo a nápoj. Zahrnuty byly také podrobnosti týkající se množství a přípravy každého jídla a/nebo nápoje. Jakmile byly do softwaru zadány všechny relevantní informace týkající se potraviny nebo nápoje, byl poskytnut a následně uložen odpovídající seznam obsahu makro a mikroživin. Tento proces byl opakován pro všechny potraviny a nápoje uvedené v dietním záznamu. Pokud konkrétní potravina nebo nápoj nebyl nalezen v databázi Nutritionist Pro, výzkumník ručně zadal obsah makro a mikroživin této konkrétní potraviny a uložil jej do databáze pro budoucí použití. Zpětná vazba poskytovaná softwarem pro každé jídlo nebo nápoj zahrnovala následující dietní proměnné: celkový energetický příjem (kalorie), hmotnost jídla (gramy), bílkoviny (gramy), sacharidy (gramy), celkový obsah tuku (gramy), celkový cukr ( gramatiky) a kofein (mikrogramatiky).