만성 운동이 인간 백색지방조직의 UCP1 유전자에 미치는 영향

조사자들은 3개의 다른 8주 운동 프로그램[에어로빅(참가자 9명), 저항(참가자 8명), 결합(호기성+저항 , 참가자 8명)] 및 비운동 그룹(7명 참가자), 8주간의 훈련 해제 기간이 뒤따릅니다. 운동강도는 운동기간 내내 최고산소소비량(VO2peak)의 65%, 최대 1RM(1RM)으로 설정하였으며, 운동 프로그램의 내용은 UCP1을 증가시킨다고 생각되는 PGC1a 유전자를 조사한 선행연구를 바탕으로 하였다. 인간의 백색 지방 조직(WAT)에서. 참가자 간의 교차 오염을 방지하기 위해 모든 운동 그룹에 대해 그리스 테살리아 트리칼라에 있는 3개의 지역 체육관에서 운동을 수행했으며 운동 감독자는 연구의 목적을 알지 못했습니다. 기준선, 운동 후(8주차) 및 훈련 해제 후(16주차) 기간에 인체 측정, 체성분, 휴식 에너지 ​​소비(REE) 및 피하 지방 생검에 대한 측정치를 얻었고, 다이어트 데이터는 주중 2일 동안 무작위로 수집했습니다. 기준선의 주말 하루, 8주 및 16주. VO2peak와 1RM은 베이스라인, 4주차(필요한 운동강도를 65%로 조정), 8주차, 16주차에 측정하였다.

인체 측정 참가자들은 오전 07:00~09:00 사이에 실험실을 방문하여 다음과 같은 인체 측정 측정에 참여했습니다. 신장은 Seca(Hamburg, Germany) 장치를 사용하여 체중을 측정(KERN & Sohn GmbH, Version 5.3, Germany) ) 허리-엉덩이 비율은 줄자를 이용하여 측정하였고 혈압은 아네로이드 혈압계를 이용한 음향학적 방법으로 측정하였다. 체지방률 및 제지방량은 체성분 모니터(Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA D-61346 Bad Hamburg, Germany)를 사용하여 생체 전기 임피던스를 통해 측정되었습니다.

지방 생검 모든 생검은 비 투열 요법을 통한 이전 방법론에 따라 숙련된 외과의에 의해 수행되었습니다. 참가자들은 최소 8시간 금식 후 피하 지방 생검을 받았고 잘못된 결과의 위험을 최소화하기 위해 생검 절차 전 72시간 동안 운동, 음주 및 수동 흡연을 삼가도록 지시받았습니다. 각 참가자는 앙와위 자세로 수술 침대에 위치했습니다. 절개 부위를 소독하고 국부 마취를 위해 자일로카인 2%-no adrenaline 10 ml를 절개 부위에 주입하였다. 지방 조직이 드러날 때까지 피부와 피하 조직을 절개하였으며, 절개 길이는 약 2-2.5cm, 배꼽 부근에서 약 3-5cm 정도 절개하였습니다. 그 후, 수술용 가위로 피하 조직을 제거하고 지방 조직이 보일 때 거의 500mg의 지방 조직을 포획하여 제거했습니다. 채취한 지방조직을 즉시 -190℃의 액체질소에 담갔다. 최종 증착을 위해 샘플을 Eppendorfs에 넣고 분석할 때까지 -80°C의 냉동고에 보관했습니다.

UCP1 mRNA 분석 유전자 및 단백질 발현 분석을 수행한 연구자는 연구 목적에 대해 눈이 멀었습니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 RNeasy Lipid Tissue mini 키트(QIAGEN)를 사용하여 지방 조직 생검에서 총 RNA를 추출했습니다. 무작위 프라이머 및 M-MLV 역전사 효소(Promega)를 사용하여 동량의 전체 RNA로부터 첫 번째 가닥 cDNA를 합성했습니다. Sybr Green 형광단을 사용하여 UCP1 유전자에 대한 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응을 수행했습니다. 모든 주기에서 형광의 변화를 모니터링하고 각 반응에 대한 배경 이상의 임계값 주기를 계산했습니다. 모든 반응에 대해 단일 증폭 제품을 보장하기 위해 모든 실행 후 용융 곡선 분석을 수행했습니다. 모든 반응은 모든 샘플에 대해 적어도 중복으로 수행되었습니다. 18S rRNA 유전자는 모든 실험 조건에서 지속적으로 발현되었으며, 이 유전자가 UCP1 mRNA의 정규화에 가장 적합한 것으로 제시되어 정규화를 위한 참조 유전자로 사용하였다.

UCP1 단백질 분석 피하 지방 조직을 프로테아제 억제제(Sigma-Aldrich, Milan, Italy)가 포함된 RIPA Lysis Buffer에서 균질화하고 4°C에서 10분 동안 800g에서 원심분리한 다음 중간층을 수집했습니다. 동량(50마이크로그램)의 단백질을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분리하여 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮겼습니다. 피하 지방 조직 샘플의 UCP1은 각각 토끼 다클론 항인간 UCP1(1:1000, Sigma-Aldrich, Milan, Italy) 및 마우스 단클론 항인간 β-액틴(1:5000, Sigma-Aldrich, 밀라노, 이탈리아). 2차 항체는 UCP1에 대한 퍼옥시다제 결합 항-토끼 IgG 및 β-액틴에 대한 항-마우스 IgG였다. 100uM 멘톨로 처리된 인간 지방세포는 이전 방법론에 따라 UCP1 단백질 발현에 대한 양성 대조군으로 사용되었습니다. Immobilion Western Chemiluminescent HRP Substrate(Millipore)를 사용하여 Western blotting 분석을 수행하고 사진 필름을 사용하여 검출했습니다. 이미지는 단백질 염색의 상대적인 양을 평가하고 광학 밀도 측면에서 결과를 정량화하는 농도계로 분석되었습니다.

REE 평가 REE 평가는 12시간 금식 후 오전 07:00에서 09:00 사이에 수행되었으며 참가자는 측정 전 72시간 동안 운동, 알코올 및 수동 흡연을 자제했습니다. REE는 참가자에게 부착된 자동 가스 분석기(Vmax, CareFusion, USA)를 사용하여 섭씨 22-24°의 조용한 방에서 30분 동안 누운 자세로 20초마다 호흡 변수를 기록했습니다. 수집된 데이터의 30분에서 처음과 마지막 5분을 제거했습니다. 마지막으로 수집된 데이터의 나머지 20분을 평균하여 최종 REE(칼로리) 값을 얻었습니다. 호흡 가스 측정값은 VO2 및 VCO2 값을 REE(칼로리) 값으로 변환하기 위해 Weir 방정식을 사용하여 추출되었습니다. REE 측정의 정확성을 보장하기 위해 평균 호흡 교환 비율도 이전 방법론에 따라 확인되었습니다.

VO2peak 및 1RM 평가 기준선에서 신체 활동 준비 설문지를 사용하여 VO2peak 테스트를 수행할 수 있는 적격성을 확인하기 위해 각 참가자에 대해 사전 선별을 수행했습니다. 참가자가 VO2peak 테스트에 익숙해질 수 있도록 사전에 프로토콜에 대한 자세한 구두 설명이 제공되었습니다. 이 프로토콜에는 스웨덴 Vansbro의 Monark Ergomedic 839E에서 5분간의 워밍업과 사이클링의 친숙화 기간이 포함되었습니다. 결과적으로 테스트에는 60와트에서 분당 60회전으로 3분 동안 페달을 밟은 다음 완전히 탈진될 때까지 분당 30와트씩 증가하는 것이 포함되었습니다. 자동 가스 분석기(Vmax, CareFusion, USA)를 참가자에게 부착하여 20초마다 호흡 변수를 기록했습니다. 20초 간격 동안 가장 높은 산소 섭취량(밀리리터/분)이 최종 VO2peak 값으로 기록되었습니다.

레그 익스텐션과 체스트 프레스의 1RM은 다음과 같이 테스트하였다. 10회 이상 반복할 수 없도록 각 참가자에 적합한 중량을 조정하였다. 그런 다음 반복 횟수를 계산하고 규범을 사용하여 각 참가자가 들어 올린 무게(kg)와 수행된 반복 횟수를 사용하여 1RM을 예측했습니다.

식이 평가 참가자는 3일간의 식단 기록을 완료하기 위해 일주일 동안 3일(평일 2일, 주말 1일)에 연구 목적을 알지 못하는 독립적인 조수로부터 전화로 무작위로 연락을 받았습니다. 접촉 당일 소비된 모든 음식과 음료를 기록했습니다. 개입 8주 및 16주차 기준선에서 3일 식단 기록을 수집했습니다. 모든 식단 기록은 영양사 Pro, 버전 5.4.0을 사용하여 연구의 목적을 알지 못하는 다른 훈련된 조수에 의해 분석되었습니다. Axxya Systems(미국 워싱턴주 레드몬드). 이 소프트웨어(예: 영양사 Pro)는 이전에 연구 목적으로 사용되었습니다. 분석을 위해 영양사 Pro에서 소비된 각 식품 및 음료에 대한 검색을 수행했습니다. 각 음식 및/또는 음료의 양과 준비에 관한 세부 사항도 포함되었습니다. 식품 또는 음료에 관한 모든 관련 정보가 소프트웨어에 입력되면 해당 매크로 및 미량 영양소 함량 목록이 제공되고 이후 저장됩니다. 이 과정은 다이어트 기록에 나열된 모든 음식과 음료에 대해 반복되었습니다. Nutritionist Pro 데이터베이스에서 특정 음식이나 음료를 찾을 수 없는 경우 조사자는 해당 특정 음식의 매크로 및 미량 영양소 함량을 수동으로 입력하고 나중에 사용할 수 있도록 데이터베이스에 저장했습니다. 각 음식 또는 음료에 대해 소프트웨어가 제공한 피드백에는 총 에너지 섭취량(칼로리), 음식 무게(문법), 단백질(문법), 탄수화물(문법), 총 지방(문법), 총 설탕(문법) 등의 식이 변수가 포함되었습니다. 문법) 및 카페인(마이크로 문법).