Los efectos del ejercicio crónico en el gen UCP1 en tejido adiposo blanco humano

Los investigadores obtuvieron tres biopsias de grasa subcutánea (basales, posteriores al ejercicio y posteriores al entrenamiento) de 32 hombres sanos que realizaron tres programas diferentes de ejercicio de ocho semanas [aeróbico (9 participantes), resistencia (8 participantes), combinado (aeróbico+resistencia , 8 participantes)] y un grupo sin ejercicio (7 participantes), seguido de un período de desentrenamiento de ocho semanas. La intensidad del ejercicio se fijó en el 65 % del consumo máximo de oxígeno (VO2pico) y 1 repetición máxima (1RM) durante todo el período de ejercicio, mientras que el contenido de los programas de ejercicio se basó en un estudio previo que examinó el gen PGC1a, que se cree que aumenta la UCP1. en tejido adiposo blanco humano (WAT). Ejercicio realizado en tres gimnasios locales en Trikala, Thessaly, Grecia, cada uno para cada grupo de ejercicio para evitar la contaminación cruzada entre los participantes, mientras que los supervisores de ejercicio desconocían el objetivo del estudio. Se obtuvieron mediciones de antropometría, composición corporal, gasto de energía en reposo (REE) y biopsia de grasa subcutánea al inicio, después del ejercicio (semana 8) y después del entrenamiento (semana 16), mientras que los datos de la dieta se recopilaron aleatoriamente durante dos días de la semana y un día de fin de semana al inicio del estudio, semana 8 y 16. El VO2pico y 1RM se midieron al inicio del estudio, la 4ª semana (para ajustar la intensidad de ejercicio requerida al 65%), la 8ª y la 16ª semana.

Antropometría Los participantes visitaron el laboratorio entre las 07:00 y las 09:00 horas y se tomaron las siguientes medidas antropométricas: Se midió la talla con aparato Seca (Hamburgo, Alemania) y el peso con báscula (KERN & Sohn GmbH, Versión 5.3, Alemania). ) mientras que la relación cintura-cadera se midió con una cinta métrica y la presión arterial a través de un método acústico con un esfigmomanómetro aneroide. El porcentaje de grasa corporal y la masa sin grasa se midieron mediante impedancia bioeléctrica utilizando un monitor de composición corporal (Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA D-61346 Bad Hamburg, Alemania).

Biopsias de grasa Todas las biopsias fueron realizadas por un cirujano experimentado siguiendo una metodología previa mediante un método sin diatermia. Los participantes se sometieron a una biopsia de grasa subcutánea después de un ayuno de al menos ocho horas y se les indicó que se abstuvieran del ejercicio, el alcohol y el tabaquismo pasivo en las 72 horas previas al procedimiento de biopsia para minimizar el riesgo de resultados engañosos. Cada participante se colocó en una cama quirúrgica en posición supina. Se desinfectó el sitio de la incisión y se inyectaron 10 ml de xilocaína al 2% sin adrenalina en la región de la incisión para anestesia local. Se realizó una incisión en la piel y el tejido subcutáneo hasta revelar el tejido adiposo, aproximadamente 3-5 centímetros cerca del ombligo, mientras que la longitud de la incisión fue de aproximadamente 2-2,5 centímetros. Posteriormente, se eliminó el tejido subcutáneo con una tijera quirúrgica y cuando el tejido adiposo se hizo visible se capturaron y extrajeron casi 500 miligramos de tejido adiposo. El tejido adiposo recolectado se sumergió inmediatamente en nitrógeno líquido a -190° Celsius. Para la deposición final las muestras se colocaron en Eppendorfs y se depositaron en un congelador a -80° Celsius hasta su análisis.

Análisis de ARNm de UCP1 Los investigadores que realizaron los análisis de expresión de genes y proteínas desconocían el objetivo del estudio. El ARN total se extrajo de biopsias de tejido adiposo utilizando el mini kit RNeasy Lipid Tissue (QIAGEN) siguiendo el protocolo del fabricante. Los ADNc de primera cadena se sintetizaron a partir de cantidades iguales de ARN total utilizando cebadores aleatorios y transcriptasa inversa M-MLV (Promega). La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real para el gen UCP1 se realizó utilizando el fluoróforo Sybr Green. Se controló el cambio de fluorescencia en cada ciclo y se calculó un ciclo umbral por encima del fondo para cada reacción. Se realizó un análisis de la curva de fusión después de cada corrida para asegurar un solo producto amplificado para cada reacción. Todas las reacciones se llevaron a cabo al menos por duplicado para cada muestra. El gen 18S rRNA se expresó constantemente en todas las condiciones experimentales y luego se utilizó como gen de referencia para la normalización dado que este gen se sugirió como el más apropiado para la normalización del mRNA de UCP1.

Análisis de proteína UCP1 Se homogeneizó tejido adiposo subcutáneo en tampón de lisis RIPA con inhibidores de proteasa (Sigma-Aldrich, Milán, Italia), se centrifugó a 800 g durante 10 minutos a 4 °C y luego se recogió la capa intermedia. Se separaron cantidades iguales (50 microgramos) de proteínas en gel de SDS-poliacrilamida al 10%, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La UCP1 de muestras de tejido adiposo subcutáneo se detectó mediante anticuerpos primarios, respectivamente policlonal de conejo anti-UCP1 humano (1:1000, Sigma-Aldrich, Milán, Italia) y monoclonal de ratón anti-actina humana (1:5000, Sigma-Aldrich, Milán, Italia). Los anticuerpos secundarios fueron IgG anti-conejo conjugado con peroxidasa para UCP1 e IgG anti-ratón para β-actina. Los adipocitos humanos que se trataron con mentol 100 uM se usaron como controles positivos para la expresión de la proteína UCP1 de acuerdo con la metodología anterior. El análisis de transferencia Western se realizó utilizando Immobilion Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore) y la detección se realizó utilizando películas fotográficas. Las imágenes han sido analizadas por densitometría, que evalúa la cantidad relativa de tinción de proteínas y cuantifica los resultados en términos de densidad óptica.

Evaluaciones de REE Las evaluaciones de REE se realizaron entre las 07:00 y las 09:00 am después de 12 horas de ayuno, mientras que los participantes se abstuvieron de hacer ejercicio, beber alcohol y fumar pasivamente en las 72 horas anteriores a las mediciones. REE se midió utilizando un analizador de gases automatizado (Vmax, CareFusion, EE. UU.) que se adjuntó a los participantes para registrar las variables respiratorias cada 20 segundos en una posición supina durante 30 minutos en una habitación tranquila de 22-24 ° Celsius. De los 30 minutos de los datos recopilados, se eliminaron los primeros y últimos cinco minutos. Finalmente, se promediaron los 20 minutos restantes de los datos recopilados para obtener el valor final de REE (calorías). Las mediciones de gases respiratorios se extrajeron utilizando la ecuación de Weir para convertir los valores de VO2 y VCO2 en valores de REE (calorías). Para garantizar la precisión de las mediciones de REE, también se verificó la tasa de intercambio respiratorio promedio de acuerdo con la metodología anterior.

Evaluaciones de VO2máx y 1RM Al inicio del estudio, se realizó una preselección para que cada participante identificara su elegibilidad para realizar una prueba de VO2máx utilizando el Cuestionario de Preparación para la Actividad Física. Para asegurar la familiarización de los participantes con la prueba de VO2máx, se proporcionó previamente una descripción verbal detallada del protocolo. El protocolo involucró un calentamiento de cinco minutos y un período de familiarización de un ciclismo en un Monark Ergomedic 839E, Vansbro, Suecia. En consecuencia, la prueba involucró tres minutos de pedaleo a 60 revoluciones por minuto a 60 Watts seguido de un incremento de 30 Watts/minuto hasta el agotamiento voluntario. Se adjuntó a los participantes un analizador de gases automatizado (Vmax, CareFusion, EE. UU.) para registrar las variables respiratorias cada 20 segundos. El consumo de oxígeno más alto (mililitros/minuto) para cualquier intervalo de 20 segundos se registró como el valor final de VO2pico.

La 1RM de extensión de piernas y press de pecho se evaluó de la siguiente manera: Se ajustó un peso adecuado para cada participante con el fin de no poder levantarlo por no más de 10 repeticiones. Luego se calculó el número de repeticiones y se utilizó una norma para predecir la 1RM utilizando el peso en kilogramos que levantó cada participante y el número de repeticiones que se realizaron.

Evaluación de la dieta Los participantes fueron contactados aleatoriamente por teléfono, por un asistente independiente que desconocía el objetivo del estudio, en tres días separados (dos días de semana, un día de fin de semana) durante un período de una semana para completar un registro de dieta de tres días. Se registraron todos los alimentos y bebidas consumidos el día del contacto. Los registros de la dieta de tres días se recopilaron al inicio, a las semanas 8 y 16 de la intervención. Todos los registros de la dieta fueron analizados por otro asistente capacitado que desconocía el objetivo del estudio utilizando Nutritionist Pro, versión 5.4.0, Axxya Systems (Redmond, WA, EE. UU.). Este software (es decir, Nutritionist Pro) se ha utilizado anteriormente con fines de investigación. Para el análisis se realizó una búsqueda en Nutritionist Pro por cada alimento y bebida consumidos. También se incluyeron detalles sobre la cantidad y preparación de cada alimento y/o bebida. Una vez que se ingresó en el software toda la información relevante sobre el alimento o la bebida, se proporcionó una lista correspondiente del contenido de macro y micronutrientes y, posteriormente, se guardó. Este proceso se repitió para todos los alimentos y bebidas enumerados en el registro de la dieta. Si un alimento o bebida en particular no se encontraba en la base de datos de Nutritionist Pro, el investigador ingresaba manualmente el contenido de macro y micronutrientes de ese alimento en particular y lo guardaba en la base de datos para uso futuro. La retroalimentación proporcionada por el software para cada alimento o bebida incluía las siguientes variables dietéticas: consumo total de energía (calorías), peso del alimento (gramáticas), proteína (gramáticas), carbohidratos (gramáticas), grasa total (gramáticas), azúcar total ( gramáticas) y cafeína (microgramáticas).