Kroonisen harjoittelun vaikutukset UCP1-geeniin ihmisen valkoisessa rasvakudoksessa

Tutkijat saivat kolme (perustilanne, harjoituksen ja harjoituksen jälkeen) ihonalaista rasvabiopsiaa 32 terveeltä mieheltä, jotka osallistuivat kolmeen eri kahdeksan viikon harjoitusohjelmaan [aerobinen (9 osallistujaa), vastustuskyky (8 osallistujaa), yhdistetty (aerobinen + vastustuskyky) , 8 osallistujaa)] ja ei-harjoitteluryhmä (7 osallistujaa), jota seuraa kahdeksan viikon harjoituksen lopetusjakso. Harjoituksen intensiteetiksi asetettiin 65 % huippuhapenkulutuksesta (VO2peak) ja 1 toisto maksimi (1RM) koko harjoitusjakson ajan, kun taas harjoitusohjelmien sisältö perustui aikaisempaan tutkimukseen, jossa tutkittiin PGC1a-geeniä, jonka uskotaan lisäävän UCP1:tä. ihmisen valkoisessa rasvakudoksessa (WAT). Harjoituksia suoritettiin kolmella paikallisella kuntosalilla Trikalassa, Thessaliassa, Kreikassa, jokaisessa harjoitusryhmässä osallistujien välisen ristikontaminaation välttämiseksi, kun taas harjoituksen valvojat olivat sokaistuneet tutkimuksen tavoitteesta. Antropometriaa, kehon koostumusta, lepoenergian kulutusta (REE) ja ihonalaista rasvabiopsiaa koskevat mittaukset otettiin lähtötilanteessa, harjoituksen jälkeen (viikko 8) ja harjoituksen lopettamisen jälkeen (viikko 16), kun taas ruokavaliotietoja kerättiin satunnaisesti kahdelta arkipäivältä ja yksi viikonloppupäivä lähtötilanteessa, 8. ja 16. viikko. VO2-huippu ja 1RM mitattiin lähtötasolla, 4. (vaaditun harjoituksen intensiteetin säätämiseksi 65 prosenttiin), 8. ja 16. viikolla.

Antropometria Osallistujat vierailivat laboratoriossa klo 07.00-09.00 ja osallistuivat seuraavat antropometriset mittaukset: Pituus mitattiin Seca-laitteella (Hamburg, Saksa) ja paino vaa'alla (KERN & Sohn GmbH, versio 5.3, Saksa) ), kun taas vyötärön ja lantion välinen suhde mitattiin mittanauhalla ja verenpaine akustisella menetelmällä käyttäen Aneroid-sfygmomanometriä. Kehon rasvaprosentti ja rasvaton massa mitattiin biosähköisen impedanssin avulla käyttämällä kehon koostumuksen monitoria (Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA D-61346 Bad Hamburg, Saksa).

Rasvabiopsiat Kaikki biopsiat suoritti kokenut kirurgi noudattaen aikaisempaa menetelmää ei-diatermiamenetelmällä. Osallistujille otettiin ihonalainen rasvakoepala vähintään kahdeksan tunnin paaston jälkeen, ja heitä kehotettiin pidättäytymään harjoituksesta, alkoholista ja passiivisesta tupakoinnista 72 tuntia ennen biopsiaa harhaanjohtavien tulosten riskin minimoimiseksi. Jokainen osallistuja asetettiin kirurgiselle sängylle makuuasentoon. Viiltokohta desinfioitiin ja 10 ml ksylokaiinia, jossa oli 2 % adrenaliinia, ruiskutettiin viillon alueelle paikallispuudutusta varten. Ihon ja ihonalaisen kudoksen viilto, kunnes rasvakudos paljastui, tehtiin noin 3-5 senttimetriä lähelle navaa, kun viillon pituus oli noin 2-2,5 senttimetriä. Tämän jälkeen ihonalainen kudos poistettiin leikkaussaksilla ja kun rasvakudos tuli näkyviin, lähes 500 milligrammaa rasvakudosta otettiin talteen ja poistettiin. Kerätty rasvakudos upotettiin välittömästi -190 celsiusasteiseen nestetyppeen. Lopullista saostusta varten näytteet laitettiin Eppendorfsiin ja ne laitettiin pakastimeen -80 °C:seen analyyseihin asti.

UCP1-mRNA-analyysi Geeni- ja proteiiniekspressioanalyysit suorittaneet tutkijat sokaisivat tutkimuksen tavoitteen. Kokonais-RNA uutettiin rasvakudosbiopsioista käyttämällä RNeasy Lipid Tissue -minipakkausta (QIAGEN) noudattaen valmistajan protokollaa. Ensimmäisen juosteen cDNA:t syntetisoitiin yhtä suurista määristä kokonais-RNA:ta käyttämällä satunnaisia ​​alukkeita ja M-MLV-käänteiskopioijaentsyymiä (Promega). Kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio UCP1-geenille suoritettiin käyttämällä Sybr Green -fluoroforia. Fluoresenssin muutosta jokaisessa syklissä tarkkailtiin ja kullekin reaktiolle laskettiin taustan yläpuolella oleva kynnyssykli. Sulamiskäyräanalyysi suoritettiin jokaisen ajon jälkeen sen varmistamiseksi, että jokaisessa reaktiossa on yksi monistettu tuote. Kaikki reaktiot suoritettiin vähintään kahtena kappaleena jokaiselle näytteelle. 18S-rRNA-geeni ilmentyi jatkuvasti kaikissa koeolosuhteissa ja sitä käytettiin sitten vertailugeeninä normalisoinnissa, koska tätä geeniä ehdotettiin sopivimmaksi UCP1-mRNA:n normalisoimiseksi.

UCP1-proteiinianalyysi Ihonalainen rasvakudos homogenisoitiin RIPA-lyysipuskurissa proteaasi-inhibiittoreiden kanssa (Sigma-Aldrich, Milano, Italia), sentrifugoitiin 800 g:ssä 10 minuuttia 4 °C:ssa ja sitten keskikerros kerättiin. Samat määrät (50 mikrogrammaa) proteiineja erotettiin 10 % SDS-polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. UCP1 ihonalaisista rasvakudosnäytteistä havaittiin primaarisilla vasta-aineilla, vastaavasti kanin polyklonaalinen anti-ihmisen UCP1 (1:1000, Sigma-Aldrich, Milano, Italia) ja hiiren monoklonaalinen anti-ihmisen β-aktiini (1:5000, Sigma-Aldrich, Milano, Italia). Toissijaiset vasta-aineet olivat peroksidaasilla konjugoitua kanin vastaista IgG:tä UCP1:lle ja anti-hiiren IgG:tä p-aktiinille. Ihmisen adiposyyttejä, joita käsiteltiin 100 uM mentolilla, käytettiin positiivisina kontrolleina UCP1-proteiinin ilmentymiselle aikaisemman metodologian mukaisesti. Western blot -analyysi suoritettiin käyttämällä Immobilion Western Chemiluminescent HRP -substraattia (Millipore) ja havaitseminen tehtiin käyttämällä valokuvafilmejä. Kuvat on analysoitu densitometrillä, joka arvioi proteiinivärjäytymisen suhteellisen määrän ja kvantifioi tulokset optisen tiheyden suhteen.

REE-arvioinnit REE-arvioinnit suoritettiin klo 07.00-09.00 välisenä aikana 12 tunnin paaston jälkeen, kun taas osallistujat pidättyivät liikunnasta, alkoholista ja passiivisesta tupakoinnista 72 tuntia ennen mittauksia. REE mitattiin käyttämällä automatisoitua kaasuanalysaattoria (Vmax, CareFusion, USA), joka oli kiinnitetty osallistujiin rekisteröimään hengitysmuuttujia 20 sekunnin välein makuuasennossa 30 minuutin ajan hiljaisessa huoneessa, jonka lämpötila oli 22-24 °C. Kerätyn datan 30 minuutista poistettiin ensimmäinen ja viimeinen viisi minuuttia. Lopuksi loput 20 minuuttia kerätystä tiedosta laskettiin keskiarvoon lopullisen REE-arvon (kalorit) saamiseksi. Hengityskaasumittaukset erotettiin käyttämällä Weir-yhtälöä VO2- ja VCO2-arvojen muuntamiseksi REE-arvoiksi (kalorit). REE-mittausten tarkkuuden varmistamiseksi myös keskimääräinen hengitysvaihtosuhde varmistettiin aikaisemman metodologian mukaisesti.

VO2peak- ja 1RM-arvioinnit Lähtötasolla kullekin osallistujalle suoritettiin esiseulonta, jotta he pystyivät selvittämään heidän kelpoisuutensa suorittaa VO2piikin testi käyttämällä fyysisen aktiivisuuden valmiuskyselyä. Osallistujien perehtymisen varmistamiseksi VO2peak-testiin annettiin etukäteen yksityiskohtainen sanallinen kuvaus protokollasta. Protokolla sisälsi viiden minuutin lämmittelyn ja tutustumisjakson pyöräilyyn Monark Ergomedic 839E:llä, Vansbro, Ruotsi. Näin ollen testi sisälsi kolmen minuutin polkemisen nopeudella 60 kierrosta minuutissa 60 watin teholla, mitä seurasi 30 watin lisäys minuutissa tahdonvoimaiseen uupumukseen asti. Automaattinen kaasuanalysaattori (Vmax, CareFusion, USA) kiinnitettiin osallistujiin rekisteröimään hengitysmuuttujia 20 sekunnin välein. Korkein hapenotto (millilitraa/minuutti) millä tahansa 20 sekunnin aikavälillä kirjattiin lopulliseksi VO2-huippuarvoksi.

Jalkojen venytyksen 1 RM ja rintapunnerrus testattiin seuraavasti: Jokaiselle osallistujalle säädettiin sopiva paino, jotta sitä ei pystytty nostamaan enintään 10 toistoa. Sitten laskettiin toistojen määrä ja 1RM:n ennustamiseen käytettiin normia käyttäen kunkin osallistujan nostamaa painoa kilogrammoina ja suoritettujen toistojen määrää.

Ruokavalion arviointi Osallistujiin otettiin satunnaisesti yhteyttä puhelimitse - tutkimuksen tavoitteelle sokeutuneen riippumattoman avustajan toimesta - kolmena erillisenä päivänä (kaksi arkipäivää, yksi viikonloppupäivä) viikon aikana kolmen päivän ruokavaliotietueen täyttämiseksi. Kaikki kosketuspäivänä nautitut ruoat ja juomat kirjattiin. Kolmen päivän ruokavaliotiedot kerättiin lähtötilanteessa, 8. ja 16. toimenpiteen viikolla. Kaikki ruokavaliotiedot analysoi toinen koulutettu avustaja, joka oli sokeutunut tutkimuksen tavoitteesta käyttäen Nutritionist Pron versiota 5.4.0, Axxya Systems (Redmond, WA, USA). Tämä ohjelmisto (esim. Nutritionist Pro) on aiemmin käytetty tutkimustarkoituksiin. Analyysia varten Nutritionist Prossa tehtiin haku jokaisesta nautitusta ruoasta ja juomasta. Mukana oli myös kunkin ruoan ja/tai juoman määrää ja valmistusta koskevat tiedot. Kun kaikki ruokaa tai juomaa koskevat olennaiset tiedot oli syötetty ohjelmistoon, toimitettiin vastaava luettelo makro- ja hivenravinnesisällöistä, ja se tallennettiin myöhemmin. Tämä prosessi toistettiin kaikille ruokavaliotietueessa mainituille ruoille ja juomille. Jos tiettyä ruokaa tai juomaa ei löytynyt Nutritionist Pro -tietokannasta, tutkija syötti manuaalisesti kyseisen ruoan makro- ja hivenravinnesisällöt ja tallensi sen tietokantaan tulevaa käyttöä varten. Ohjelmiston antama palaute jokaisesta ruoasta tai juomasta sisälsi seuraavat ruokavaliomuuttujat: kokonaisenergian saanti (kalorit), ruoan paino (kielioppi), proteiini (kielioppia), hiilihydraatti (kielioppia), kokonaisrasva (kielioppi), kokonaissokeri ( kieliopit) ja kofeiini (mikrokieliopit).