Os efeitos do exercício crônico no gene UCP1 no tecido adiposo branco humano

Os investigadores obtiveram três biópsias de gordura subcutânea (basal, pós-exercício, pós-destreino) de 32 homens saudáveis ​​que realizaram três diferentes programas de exercícios de oito semanas [aeróbico (9 participantes), resistência (8 participantes), combinado (aeróbico + resistência , 8 participantes)] e um grupo sem exercício (7 participantes), seguido de um período de oito semanas sem treinamento. A intensidade do exercício foi fixada em 65% do consumo máximo de oxigênio (VO2pico) e 1 repetição máxima (1RM) durante todo o período de exercício, enquanto o conteúdo dos programas de exercícios foi baseado em um estudo anterior que examinou o gene PGC1a, que se acredita aumentar a UCP1 no tecido adiposo branco humano (WAT). Exercício realizado em três academias locais em Trikala, Tessália, Grécia, cada um para cada grupo de exercícios para evitar a contaminação cruzada entre os participantes, enquanto os supervisores dos exercícios desconheciam o objetivo do estudo. Medidas de antropometria, composição corporal, gasto energético em repouso (GER) e biópsia de gordura subcutânea foram obtidas nos períodos inicial, pós-exercício (semana 8) e pós-destreinamento (semana 16), enquanto os dados da dieta foram coletados aleatoriamente por dois dias da semana e um dia de fim de semana na linha de base, 8ª e 16ª semanas. O VO2pico e 1RM foram medidos no início, 4ª (para ajustar a intensidade de exercício necessária em 65%), 8ª e 16ª semana.

Antropometria Os participantes compareceram ao laboratório entre 07h00 e 09h00 e realizaram as seguintes medidas antropométricas: Altura medida em aparelho Seca (Hamburgo, Alemanha) e peso em balança (KERN & Sohn GmbH, Versão 5.3, Alemanha ), enquanto a relação cintura-quadril foi medida com fita métrica e a pressão arterial por método acústico com esfigmomanômetro Aneróide. O percentual de gordura corporal e a massa livre de gordura foram medidos por impedância bioelétrica usando um monitor de composição corporal (Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA D-61346 Bad Hamburg, Germany).

Biópsias de gordura Todas as biópsias foram realizadas por um cirurgião experiente seguindo uma metodologia prévia por método não diatérmico. Os participantes foram submetidos a uma biópsia de gordura subcutânea após pelo menos oito horas de jejum e foram instruídos a abster-se de exercícios, álcool e fumo passivo nas 72 horas anteriores ao procedimento de biópsia, a fim de minimizar o risco de resultados enganosos. Cada participante foi posicionado em uma cama cirúrgica em decúbito dorsal. O local da incisão foi desinfetado e 10 ml de xilocaína 2% sem adrenalina foram injetados na região da incisão para anestesia local. Uma incisão na pele e no tecido subcutâneo até que o tecido adiposo fosse revelado, foi executada aproximadamente 3-5 centímetros próximo ao umbigo, enquanto o comprimento da incisão foi de aproximadamente 2-2,5 centímetros. Posteriormente, o tecido subcutâneo foi removido com uma tesoura cirúrgica e quando o tecido adiposo se tornou visível, cerca de 500 miligramas de tecido adiposo foram capturados e removidos. O tecido adiposo coletado foi imediatamente imerso em nitrogênio líquido a -190° Celsius. Para a deposição final as amostras foram colocadas em Eppendorfs e foram depositadas em freezer a -80° Celsius até as análises.

Análise de mRNA de UCP1 Os investigadores que realizaram as análises de expressão de genes e proteínas desconheciam o objetivo do estudo. O RNA total foi extraído de biópsias de tecido adiposo usando o mini kit RNeasy Lipid Tissue (QIAGEN) seguindo o protocolo do fabricante. Os ADNc da primeira cadeia foram sintetizados a partir de quantidades iguais de ARN total utilizando iniciadores aleatórios e transcriptase reversa M-MLV (Promega). A reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real para o gene UCP1 foi realizada usando o fluoróforo Sybr Green. A mudança na fluorescência em cada ciclo foi monitorada e um ciclo limite acima do fundo para cada reação foi calculado. Uma análise da curva de fusão foi realizada após cada execução para garantir um único produto amplificado para cada reação. Todas as reações foram realizadas pelo menos em duplicata para cada amostra. O gene 18S rRNA foi constantemente expresso em todas as condições experimentais e foi então usado como gene de referência para normalização, visto que este gene foi sugerido como o mais adequado para normalização do mRNA UCP1.

Análise da proteína UCP1 O tecido adiposo subcutâneo foi homogeneizado em RIPA Lysis Buffer com inibidores de protease (Sigma-Aldrich, Milão, Itália), centrifugado a 800g por 10 minutos a 4° Celsius e então a camada intermediária foi coletada. Quantidades iguais (50 microgramas) de proteínas foram separadas em gel SDS-poliacrilamida a 10%, transferidas para uma membrana de nitrocelulose. UCP1 de amostras de tecido adiposo subcutâneo foram detectados por anticorpos primários, respectivamente coelho policlonal anti-humano UCP1 (1:1000, Sigma-Aldrich, Milão, Itália) e monoclonal de camundongo anti-β-actina humana (1:5000, Sigma-Aldrich, Milão, Itália). Os anticorpos secundários foram IgG anti-coelho conjugado com peroxidase para UCP1 e IgG anti-camundongo para β-actina. Os adipócitos humanos tratados com 100uM de mentol foram usados ​​como controles positivos para a expressão da proteína UCP1 de acordo com a metodologia anterior. A análise de Western blotting foi realizada usando Immobilion Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore) e a detecção foi feita usando filmes fotográficos. As imagens foram analisadas por densitometria, que avalia a quantidade relativa de coloração de proteínas e quantifica os resultados em termos de densidade óptica.

Avaliações do GER As avaliações do GER foram realizadas entre 07:00 e 09:00 horas após 12 horas de jejum, enquanto os participantes abstiveram-se de exercícios, álcool e fumo passivo nas 72 horas anteriores às medições. O GER foi medido usando um analisador de gases automatizado (Vmax, CareFusion, EUA) que foi anexado aos participantes para registrar variáveis ​​respiratórias a cada 20 segundos em posição supina por 30 minutos em uma sala silenciosa de 22-24° Celsius. Dos 30 minutos de coleta de dados, foram retirados o primeiro e o último cinco minutos. Finalmente, os 20 minutos restantes dos dados coletados foram calculados para obter o valor final de REE (calorias). As medições dos gases respiratórios foram extraídas usando a equação de Weir para converter os valores de VO2 e VCO2 em valores REE (calorias). Para garantir a precisão das medidas do GER, também foi verificada a razão média de trocas respiratórias conforme metodologia anterior.

Avaliações de VO2pico e 1RM Na linha de base, uma pré-triagem foi realizada para cada participante para identificar sua elegibilidade para realizar um teste de VO2pico usando o Questionário de Prontidão para Atividade Física. Para garantir a familiarização dos participantes com o teste de VO2pico, foi fornecida previamente uma descrição verbal detalhada do protocolo. O protocolo envolveu um aquecimento de cinco minutos e um período de familiarização de um ciclismo em um Monark Ergomedic 839E, Vansbro, Suécia. Consequentemente, o teste envolveu três minutos de pedalada a 60 rotações por minuto a 60 Watts, seguido de um incremento de 30 Watts/minuto até a exaustão voluntária. Um analisador automático de gases (Vmax, CareFusion, EUA) foi acoplado aos participantes para registro das variáveis ​​respiratórias a cada 20 segundos. O maior consumo de oxigênio (mililitros/minuto) para qualquer intervalo de 20 segundos foi registrado como o valor final de VO2pico.

Os 1RM de leg extension e chest press foram testados da seguinte forma: Foi ajustado um peso adequado para cada participante de forma que não fosse possível levantá-lo por no máximo 10 repetições. O número de repetições foi então calculado e uma norma foi usada para prever o 1RM usando o peso em quilogramas que cada participante levantou e o número de repetições que foram realizadas.

Avaliação da dieta Os participantes foram contatados aleatoriamente por telefone - por um assistente independente que desconhecia o objetivo do estudo - em três dias separados (dois dias da semana, um dia de fim de semana) durante um período de uma semana para a conclusão de um registro alimentar de três dias. Todos os alimentos e bebidas consumidos no dia do contato foram registrados. Registros de dieta de três dias foram coletados no início, 8ª e 16ª semana da intervenção. Todos os registros de dieta foram analisados ​​por outro assistente treinado que desconhecia o objetivo do estudo usando o Nutritionist Pro, versão 5.4.0, Axxya Systems (Redmond, WA, EUA). Este software (ou seja, Nutritionist Pro) foi usado anteriormente para fins de pesquisa. Para a análise, foi realizada uma busca no Nutritionist Pro para cada alimento e bebida consumida. Detalhes sobre a quantidade e preparo de cada alimento e/ou bebida também foram incluídos. Uma vez que todas as informações relevantes sobre o alimento ou bebida foram inseridas no software, uma lista correspondente do conteúdo de macro e micronutrientes foi fornecida e posteriormente salva. Este processo foi repetido para todos os alimentos e bebidas listados no registro da dieta. Se um determinado alimento ou bebida não fosse encontrado no banco de dados do Nutritionist Pro, o investigador inseria manualmente o conteúdo de macro e micronutrientes desse alimento específico e o salvava no banco de dados para uso futuro. O feedback fornecido pelo software para cada alimento ou bebida incluiu as seguintes variáveis ​​dietéticas: ingestão total de energia (calorias), peso do alimento (gramáticas), proteína (gramáticas), carboidrato (gramáticas), gordura total (gramáticas), açúcar total ( gramáticas) e cafeína (microgramáticas).