长期运动对人体白色脂肪组织UCP1基因的影响

研究人员从 32 名健康男性身上获得了三份（基线、运动后、训练后）皮下脂肪活检，这些健康男性进行了三种不同的八周运动计划 [有氧运动（9 名参与者）、阻力运动（8 名参与者）、联合运动（有氧运动+阻力运动） , 8 名参与者）] 和一个非运动组（7 名参与者），然后是八周的去训练期。 在整个运动期间，运动强度设定为峰值耗氧量 (VO2peak) 的 65% 和最大重复次数 (1RM)，而运动计划的内容基于之前检查 PGC1a 基因的研究，该基因被认为会增加 UCP1在人类白色脂肪组织 (WAT) 中。 在希腊色萨利特里卡拉的三个当地健身房进行锻炼，每个锻炼组都进行锻炼，以避免参与者之间的交叉感染，而锻炼监督员对研究目的不知情。 在基线、运动后（第 8 周）和去训练后（第 16 周）期间获得人体测量学、身体成分、静息能量消耗 (REE) 和皮下脂肪活检的测量值，同时随机收集两个工作日的饮食数据和第 8 周和第 16 周基线的一个周末。 在基线、第 4 周（将所需运动强度调整为 65%）、第 8 周和第 16 周测量 VO2peak 和 1RM。

人体测量学 参与者在上午 07:00 至 09:00 之间参观了实验室，并采取了以下人体测量学措施：使用 Seca（德国汉堡）设备测量身高，使用秤测量体重（KERN & Sohn GmbH，版本 5.3，德国) 而腰臀比是使用卷尺测量的，血压是通过声学方法使用无液血压计测量的。 使用身体成分监测器（Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA D-61346 Bad Hamburg, Germany）通过生物电阻抗测量身体脂肪百分比和去脂质量。

脂肪活检所有活检均由经验丰富的外科医生按照先前的方法通过非透热法进行。 参与者在禁食至少 8 小时后接受了皮下脂肪活检，并指示他们在活检前 72 小时内避免运动、饮酒和被动吸烟，以尽量减少误导结果的风险。 每个参与者都被定位在仰卧位的手术床上。 切口处消毒，切口处注射2%-无肾上腺素10ml进行局麻。 在肚脐附近约 3-5 厘米处在皮肤和皮下组织上切开一个切口，直到露出脂肪组织，切口长度约为 2-2.5 厘米。 随后，用手术剪去除皮下组织，当脂肪组织变得可见时，将近 500 毫克的脂肪组织被捕获并去除。 采集的脂肪组织立即浸入-190℃的液氮中。 对于最终沉积，将样品置于 Eppendorfs 中，并将它们沉积在 -80 摄氏度的冰箱中，直到进行分析。

UCP1 mRNA 分析 进行基因和蛋白质表达分析的研究人员不知道研究的目的。 按照制造商的方案，使用 RNeasy Lipid Tissue 迷你试剂盒 (QIAGEN) 从脂肪组织活检中提取总 RNA。 使用随机引物和 M-MLV 逆转录酶 (Promega) 从等量的总 RNA 合成第一链 cDNA。 使用 Sybr Green 荧光团对 UCP1 基因进行定量实时聚合酶链反应。 监测每个循环的荧光变化，并计算每个反应高于背景的阈值循环。 每次运行后都进行熔解曲线分析，以确保每个反应都有单一的扩增产物。 对每个样品至少重复进行所有反应。 18S rRNA 基因在所有实验条件下不断表达，然后用作标准化的参考基因，因为该基因被认为是最适合 UCP1 mRNA 标准化的基因。

UCP1 蛋白分析皮下脂肪组织在含有蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解缓冲液（Sigma-Aldrich，意大利米兰）中匀浆，在 4°C 下以 800g 离心 10 分钟，然后收集中间层。 在 10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离等量（50 微克）的蛋白质，转移到硝酸纤维素膜上。 皮下脂肪组织样品中的 UCP1 通过一抗检测，分别为兔多克隆抗人 UCP1（1:1000，Sigma-Aldrich，Milan，Italy）和小鼠单克隆抗人 β-肌动蛋白（1：5000，Sigma-Aldrich，米兰，意大利）。 二抗是针对 UCP1 的过氧化物酶偶联抗兔 IgG 和针对 β-肌动蛋白的抗小鼠 IgG。 根据先前的方法，用 100uM 薄荷醇处理的人脂肪细胞用作 UCP1 蛋白表达的阳性对照。 使用 Immobilion Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore) 进行蛋白质印迹分析，并使用照相胶片进行检测。 图像已通过密度测定法进行分析，密度测定法评估蛋白质染色的相对量并根据光密度量化结果。

REE 评估 REE 评估在禁食 12 小时后的上午 07:00 至 09:00 之间进行，而参与者在测量前 72 小时内避免运动、饮酒和被动吸烟。 REE 是使用自动气体分析仪（Vmax，CareFusion，美国）测量的，该分析仪连接到参与者身上，在 22-24 摄氏度的安静房间中以仰卧姿势每 20 秒记录一次呼吸变量 30 分钟。 从收集的 30 分钟数据中，删除了前五分钟和最后五分钟。 最后，将剩余 20 分钟的采集数据进行平均，得到最终的 REE（卡路里）值。 使用 Weir 方程提取呼吸气体测量值，将 VO2 和 VCO2 值转换为 REE（卡路里）值。 为了确保 REE 测量的准确性，还根据以前的方法验证了平均呼吸交换率。

VO2peak 和 1RM 评估 在基线时，对每个参与者进行了预筛选，以确定他们是否有资格使用身体活动准备问卷进行 VO2peak 测试。 为确保参与者熟悉 VO2peak 测试，提前对协议进行了详细的口头描述。 该协议包括五分钟的热身和在瑞典范斯布罗的 Monark Ergomedic 839E 中骑自行车的熟悉期。 因此，该测试涉及以 60 瓦特的速度以每分钟 60 转的速度踩踏板三分钟，然后增加 30 瓦特/分钟，直到意志力竭。 将自动气体分析仪（Vmax，CareFusion，美国）连接到参与者以每 20 秒记录一次呼吸变量。 任何 20 秒间隔的最高摄氧量（毫升/分钟）被记录为最终的 VO2peak 值。

1RM的腿部伸展和胸部按压测试如下：为每个参与者调整合适的重量，以不超过10次重复不能举起。 然后计算重复次数，并使用标准来预测 1RM，使用每个参与者举起的重量（以千克为单位）和执行的重复次数。

饮食评估 参与者随机通过电话联系 - 由一位对研究目的不知情的独立助理 - 在一周内的三个不同的日子（两个工作日，一个周末）完成为期三天的饮食记录。 记录接触当天消耗的所有食物和饮料。 在干预的基线、第 8 周和第 16 周收集三天的饮食记录。 所有饮食记录均由另一名训练有素的助理进行分析，该助理使用 Nutritionist Pro 5.4.0 版对研究目的不知情， Axxya Systems（美国华盛顿州雷德蒙德）。 该软件（即 Nutritionist Pro) 以前曾用于研究目的。 为了进行分析，我们在 Nutritionist Pro 中对食用的每种食物和饮料进行了搜索。 还包括有关每种食物和/或饮料的数量和准备的详细信息。 一旦有关食品或饮料的所有相关信息都输入到软件中，就会提供相应的常量和微量营养素含量列表并随后保存。 对饮食记录中列出的所有食物和饮料重复此过程。 如果在 Nutritionist Pro 数据库中找不到特定的食物或饮料，研究人员会手动输入该特定食物的常量和微量营养素含量，并将其保存到数据库中以备将来使用。 软件为每种食物或饮料提供的反馈包括以下饮食变量：总能量摄入（卡路里）、食物重量（语法）、蛋白质（语法）、碳水化合物（语法）、总脂肪（语法）、总糖（语法）和咖啡因（微语法）。