De effecten van chronische inspanning op het UCP1-gen in menselijk wit vetweefsel

De onderzoekers verkregen drie (baseline, post-training, post-de-training) subcutane vetbiopten van 32 gezonde mannen die drie verschillende trainingsprogramma's van acht weken ondernamen [aerobic (9 deelnemers), weerstand (8 deelnemers), gecombineerd (aerobic+resistentie , 8 deelnemers)] en een niet-oefengroep (7 deelnemers), gevolgd door een de-trainingsperiode van acht weken. De trainingsintensiteit was vastgesteld op 65% van het piekzuurstofverbruik (VO2peak) en 1 herhalingsmaximum (1RM) gedurende de trainingsperiode, terwijl de inhoud van de trainingsprogramma's gebaseerd was op een eerdere studie waarin het PGC1a-gen werd onderzocht, waarvan wordt gedacht dat het UCP1 verhoogt in menselijk wit vetweefsel (WAT). Oefening uitgevoerd in drie lokale sportscholen in Trikala, Thessalië, Griekenland, elk voor elke oefengroep om kruisbesmetting tussen deelnemers te voorkomen, terwijl de oefenbegeleiders blind waren voor het doel van het onderzoek. Metingen voor antropometrie, lichaamssamenstelling, energieverbruik in rust (REE) en biopsie van onderhuids vet werden verkregen bij baseline, post-training (week 8) en post-de-training (week 16), terwijl dieetgegevens willekeurig werden verzameld gedurende twee weekdagen en een weekenddag bij baseline, 8e en 16e week. VO2peak en 1RM werden gemeten bij aanvang, 4e (om de vereiste trainingsintensiteit aan te passen op 65%), 8e en 16e week.

Antropometrie De deelnemers bezochten het laboratorium tussen 07:00 en 09:00 uur en de volgende antropometrische maatregelen namen deel: lengte werd gemeten met behulp van een apparaat van Seca (Hamburg, Duitsland) en gewicht met behulp van een weegschaal (KERN & Sohn GmbH, versie 5.3, Duitsland ) terwijl de taille-tot-heupverhouding werd gemeten met behulp van een meetlint en de bloeddruk via een akoestische methode met behulp van een aneroïde bloeddrukmeter. Percentage lichaamsvet en vetvrije massa werden gemeten via bio-elektrische impedantie met behulp van een lichaamssamenstellingsmonitor (Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA D-61346 Bad Hamburg, Duitsland).

Vetbiopten Alle biopsieën werden uitgevoerd door een ervaren chirurg volgens een eerdere methodologie via een niet-diathermische methode. De deelnemers ondergingen een onderhuidse vetbiopsie na ten minste acht uur vasten en ze kregen de instructie om 72 uur voorafgaand aan de biopsieprocedure af te zien van lichaamsbeweging, alcohol en passief roken om het risico op misleidende resultaten te minimaliseren. Elke deelnemer werd in rugligging op een chirurgisch bed geplaatst. De plaats van de incisie werd gedesinfecteerd en 10 ml xylocaïne 2%-geen adrenaline werd geïnjecteerd in het gebied van de incisie voor lokale anesthesie. Een incisie in de huid en het onderhuidse weefsel totdat vetweefsel zichtbaar werd, werd ongeveer 3-5 centimeter nabij de navel uitgevoerd, terwijl de lengte van de incisie ongeveer 2-2,5 centimeter was. Vervolgens werd het onderhuidse weefsel met een operatieschaar verwijderd en toen het vetweefsel zichtbaar werd, werd bijna 500 milligram vetweefsel opgevangen en verwijderd. Het verzamelde vetweefsel werd onmiddellijk ondergedompeld in vloeibare stikstof van -190° Celsius. Voor de definitieve depositie werden de monsters in Eppendorfs geplaatst en tot analyse in een vriezer bij -80° Celsius geplaatst.

UCP1-mRNA-analyse De onderzoekers die de gen- en eiwitexpressieanalyses uitvoerden, waren blind voor het doel van de studie. Totaal RNA werd geëxtraheerd uit vetweefselbiopten met behulp van RNeasy Lipid Tissue mini kit (QIAGEN) volgens het protocol van de fabrikant. Eerstestrengs cDNA's werden gesynthetiseerd uit gelijke hoeveelheden totaal RNA met behulp van willekeurige primers en M-MLV reverse transcriptase (Promega). Kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie voor het UCP1-gen werd uitgevoerd met behulp van Sybr Green-fluorofoor. De verandering in fluorescentie bij elke cyclus werd gevolgd en voor elke reactie werd een drempelcyclus boven de achtergrond berekend. Na elke run werd een smeltkromme-analyse uitgevoerd om zeker te zijn van een enkel geamplificeerd product voor elke reactie. Alle reacties werden voor elk monster ten minste in duplo uitgevoerd. Het 18S-rRNA-gen werd constant tot expressie gebracht onder alle experimentele omstandigheden en werd vervolgens gebruikt als een referentiegen voor normalisatie, aangezien dit gen werd voorgesteld als het meest geschikte gen voor normalisatie van UCP1-mRNA.

UCP1-eiwitanalyse Subcutaan vetweefsel werd gehomogeniseerd in RIPA Lysis Buffer met proteaseremmers (Sigma-Aldrich, Milaan, Italië), 10 minuten gecentrifugeerd bij 800 g bij 4° Celsius en vervolgens werd de middelste laag verzameld. Gelijke hoeveelheden (50 microgram) eiwitten werden gescheiden op 10% SDS-polyacrylamidegel, overgebracht naar een nitrocellulosemembraan. UCP1 van subcutane vetweefselmonsters werden gedetecteerd door primaire antilichamen, respectievelijk konijnen polyklonaal anti-humaan UCP1 (1:1000, Sigma-Aldrich, Milaan, Italië) en muis monoklonaal anti-humaan β-actine (1:5000, Sigma-Aldrich, Milaan, Italië). Secundaire antilichamen waren peroxidase-geconjugeerd anti-konijn IgG voor UCP1 en anti-muis IgG voor β-actine. Menselijke adipocyten die werden behandeld met 100 uM menthol werden gebruikt als positieve controles voor UCP1-eiwitexpressie volgens eerdere methodologie. Western-blotanalyse werd uitgevoerd met behulp van Immobilion Western Chemiluminescent HRP-substraat (Millipore) en detectie vond plaats met behulp van fotografische films. De beelden zijn geanalyseerd door densitometrie, die de relatieve hoeveelheid eiwitkleuring evalueert en de resultaten kwantificeert in termen van optische dichtheid.

REE-beoordelingen REE-beoordelingen werden uitgevoerd tussen 07:00 en 09:00 uur na 12 uur vasten, terwijl deelnemers 72 uur voorafgaand aan de metingen afzagen van lichaamsbeweging, alcohol en passief roken. REE werd gemeten met behulp van een geautomatiseerde gasanalysator (Vmax, CareFusion, VS) die aan de deelnemers was bevestigd om de ademhalingsvariabelen elke 20 seconden te registreren in rugligging gedurende 30 minuten in een stille kamer van 22-24° Celsius. Van de 30 minuten van de verzamelde gegevens werden de eerste en de laatste vijf minuten verwijderd. Ten slotte werden de resterende 20 minuten van de verzamelde gegevens gemiddeld om de uiteindelijke REE-waarde (calorieën) te verkrijgen. Ademhalingsgasmetingen werden geëxtraheerd met behulp van de Weir-vergelijking om VO2- en VCO2-waarden om te zetten in REE-waarden (calorieën). Om de nauwkeurigheid van de REE-metingen te garanderen, werd ook de gemiddelde respiratoire uitwisselingsverhouding geverifieerd volgens de vorige methodologie.

VO2peak- en 1RM-beoordelingen Bij baseline werd voor elke deelnemer een pre-screening uitgevoerd om vast te stellen of ze in aanmerking kwamen voor een VO2peak-test met behulp van de Physical Activity Readiness Questionnaire. Om de deelnemers vertrouwd te maken met de VO2peak-test werd vooraf een gedetailleerde mondelinge beschrijving van het protocol gegeven. Het protocol omvatte een warming-up van vijf minuten en een gewenningsperiode van fietsen in een Monark Ergomedic 839E, Vansbro, Zweden. Bijgevolg omvatte de test drie minuten trappen met 60 omwentelingen per minuut bij 60 watt, gevolgd door een toename van 30 watt/minuut tot vrijwillige uitputting. Een geautomatiseerde gasanalysator (Vmax, CareFusion, VS) werd aan de deelnemers bevestigd om elke 20 seconden ademhalingsvariabelen vast te leggen. De hoogste zuurstofopname (milliliter/minuut) voor elk interval van 20 seconden werd geregistreerd als de uiteindelijke VO2-piekwaarde.

De 1RM van leg extension en chest press werden als volgt getest: Voor elke deelnemer werd een geschikt gewicht ingesteld om niet meer dan 10 herhalingen te kunnen tillen. Het aantal herhalingen werd vervolgens berekend en er werd een norm gebruikt om de 1RM te voorspellen met behulp van het gewicht in kilogram dat elke deelnemer optilde en het aantal herhalingen dat werd uitgevoerd.

Dieetbeoordeling Deelnemers werden willekeurig telefonisch gecontacteerd - door een onafhankelijke assistent die blind was voor het doel van de studie - op drie afzonderlijke dagen (twee weekdagen, één weekenddag) gedurende een weekperiode voor het invullen van een driedaags dieetdossier. Al het eten en drinken dat op de dag van contact werd geconsumeerd, werd geregistreerd. Driedaagse dieetrecords werden verzameld bij aanvang, 8e en 16e week van de interventie. Alle voedingsgegevens werden geanalyseerd door een andere getrainde assistent die blind was voor het doel van de studie met behulp van Nutritionist Pro, versie 5.4.0, Axxya Systems (Redmond, WA, VS). Deze software (d.w.z. Nutritionist Pro) is eerder gebruikt voor onderzoeksdoeleinden. Voor de analyse werd in Nutritionist Pro gezocht naar elk geconsumeerd voedsel en elke drank. Details over de hoeveelheid en bereiding van elk voedsel en/of elke drank waren ook opgenomen. Nadat alle relevante informatie over het voedsel of de drank in de software was ingevoerd, werd een overeenkomstige lijst met macro- en micronutriënten verstrekt en vervolgens opgeslagen. Dit proces werd herhaald voor alle voedingsmiddelen en dranken die in het dieetdossier staan ​​vermeld. Als een bepaald voedingsmiddel of bepaalde drank niet werd gevonden in de Nutritionist Pro-database, voerde de onderzoeker handmatig de macro- en micronutriënteninhoud van dat specifieke voedingsmiddel in en bewaarde het in de database voor toekomstig gebruik. De feedback van de software voor elk voedingsmiddel of elke drank omvatte de volgende voedingsvariabelen: totale energie-inname (calorieën), gewicht van voedsel (grammatica's), eiwit (grammatica's), koolhydraten (grammatica's), totaal vet (grammatica's), totale suiker ( grammatica's) en cafeïne (microgrammatica's).