A krónikus gyakorlatok hatása az UCP1 génre az emberi fehér zsírszövetben

A kutatók három (alapállapotú, edzés utáni, edzés utáni) bőr alatti zsírbiopsziát kaptak 32 egészséges férfitól, akik három különböző nyolchetes edzésprogramon vettek részt [aerob (9 résztvevő), ellenállás (8 résztvevő), kombinált (aerob+rezisztencia) , 8 résztvevő)] és egy nem testmozgásos csoport (7 résztvevő), majd egy nyolchetes kiképzési időszak következett. Az edzés intenzitása a csúcs oxigénfogyasztás 65%-ában (VO2peak) és 1 ismétlési maximumban (1RM) volt beállítva a teljes edzési időszakban, míg az edzésprogramok tartalma egy korábbi tanulmányon alapult, amely a PGC1a gént vizsgálta, amelyről azt gondolják, hogy növeli az UCP1-et. emberi fehér zsírszövetben (WAT). A gyakorlatokat három helyi edzőteremben végezték el Trikalában, Thesszáliában, Görögországban, mindegyik edzéscsoportban, hogy elkerüljék a résztvevők közötti keresztszennyeződést, miközben a gyakorlatvezetőket elvakították a tanulmány céljától. Az antropometriára, a testösszetételre, a nyugalmi energiafelhasználásra (REE) és a bőr alatti zsírbiopsziára vonatkozó méréseket a kiindulási, az edzés utáni (8. hét) és az edzés utáni (16. hét) időszakokban, míg az étrendi adatokat véletlenszerűen gyűjtöttük két hétköznapon és egy hétvégi nap az alaphelyzetben, a 8. és a 16. héten. A VO2csúcsot és az 1RM-et az alapvonalon, a 4. (a szükséges edzésintenzitás 65%-os beállításához), a 8. és a 16. héten mérték.

Antropometria A résztvevők 07:00 és 09:00 óra között meglátogatták a laboratóriumot, és a következő antropometriai mérések vettek részt: A magasságot Seca (Hamburg, Németország) készülékkel, a súlyt pedig mérleggel (KERN & Sohn GmbH, 5.3-as verzió, Németország) mérték. ), míg a derék-csípő arányt mérőszalaggal, a vérnyomást pedig akusztikus módszerrel, Aneroid vérnyomásmérővel mérték. A testzsír százalékos arányát és a zsírmentes tömeget bioelektromos impedanciával mértük testösszetétel-monitorral (Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA D-61346 Bad Hamburg, Németország).

Zsírbiopsziák Minden biopsziát egy tapasztalt sebész hajtott végre egy korábbi módszert követve, nem diatermiás módszerrel. A résztvevők bőr alatti zsírbiopszián estek át legalább nyolc órás koplalás után, és arra utasították őket, hogy a biopsziás eljárás előtt 72 órában tartózkodjanak a testmozgástól, az alkoholtól és a passzív dohányzástól, hogy minimálisra csökkentsék a félrevezető eredmények kockázatát. Minden résztvevő egy sebészeti ágyra feküdt, fekvő helyzetben. A bemetszés helyét fertőtlenítettük, és 10 ml 2%-os adrenalint tartalmazó xylocaint fecskendeztünk be a metszés területére helyi érzéstelenítés céljából. A bőrön és a bőr alatti szöveten a zsírszövet feltárásáig bemetszést végeztünk a köldök közelében körülbelül 3-5 centiméterre, míg a metszés hossza körülbelül 2-2,5 centiméter volt. Ezt követően a bőr alatti szövetet operatív ollóval távolították el, majd amikor a zsírszövet láthatóvá vált, közel 500 milligramm zsírszövetet fogtak be és távolítottak el. Az összegyűjtött zsírszövetet azonnal -190 °C-os folyékony nitrogénbe merítettük. A végső lerakáshoz a mintákat Eppendorfs-ba helyeztük és -80°C-os fagyasztóba helyeztük az elemzésekig.

UCP1 mRNS analízis A gén- és fehérjeexpressziós analízist végző kutatók elvakultak a vizsgálat céljától. A zsírszöveti biopsziákból a teljes RNS-t RNeasy Lipid Tissue mini kit (QIAGEN) segítségével vontuk ki a gyártó protokollja szerint. Az első szálú cDNS-eket azonos mennyiségű teljes RNS-ből szintetizáltuk random primerek és M-MLV reverz transzkriptáz (Promega) segítségével. Az UCP1 gén kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakcióját Sybr Green fluorofor segítségével végeztük. A fluoreszcencia változását minden ciklusban figyeltük, és minden reakcióhoz kiszámítottuk a háttér feletti küszöbciklust. Minden egyes futtatást követően olvadási görbe analízist végeztünk, hogy minden reakcióhoz egyetlen amplifikált terméket biztosítsunk. Valamennyi reakciót minden minta esetében legalább kétszeresen elvégeztük. A 18S rRNS gént folyamatosan expresszálták minden kísérleti körülmény között, majd referenciagénként használták a normalizáláshoz, mivel ezt a gént javasolták a legmegfelelőbbnek az UCP1 mRNS normalizálására.

UCP1 fehérje analízis A szubkután zsírszövetet RIPA lízispufferben homogenizáltuk proteáz inhibitorokkal (Sigma-Aldrich, Milánó, Olaszország), 800 g-vel centrifugáltuk 10 percig 4 °C-on, majd a középső réteget összegyűjtöttük. Egyenlő mennyiségű (50 mikrogramm) fehérjét választottunk el 10%-os SDS-poliakrilamid gélen, majd nitrocellulóz membránra vittük át. A szubkután zsírszövetmintákból származó UCP1-et primer antitestek mutatták ki, rendre nyúl poliklonális anti-humán UCP1 (1:1000, Sigma-Aldrich, Milánó, Olaszország) és egér monoklonális anti-humán β-aktin (1:5000, Sigma-Aldrich, Milánó, Olaszország). A másodlagos antitestek peroxidázzal konjugált anti-nyúl IgG voltak az UCP1-hez és anti-egér IgG a β-aktinhoz. A 100 uM mentollal kezelt humán zsírsejteket használtuk pozitív kontrollként az UCP1 fehérje expressziójához a korábbi módszertan szerint. A Western-blot analízist Immobilion Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore) alkalmazásával, a detektálást fényképészeti filmekkel végeztük. A képeket denzitometriával elemeztük, amely értékeli a fehérjefestődés relatív mennyiségét, és számszerűsíti az eredményeket az optikai sűrűség szempontjából.

REE felmérések A REE méréseket 07:00 és 09:00 között végezték 12 óra böjt után, míg a résztvevők tartózkodtak a testmozgástól, az alkoholtól és a passzív dohányzástól a mérést megelőző 72 órában. A REE-t egy automata gázanalizátor (Vmax, CareFusion, USA) segítségével mérték, amelyet a résztvevőkhöz csatlakoztattak, hogy 20 másodpercenként rögzítsék a légzési változókat fekvő helyzetben 30 percig egy csendes, 22-24 °C-os helyiségben. A gyűjtött adatok 30 percéből az első és az utolsó öt percet eltávolítottuk. Végül az összegyűjtött adatok fennmaradó 20 percét átlagoltuk, hogy megkapjuk a végső REE (kalória) értéket. A légúti gáz méréseit a Weir-egyenlet segítségével vontuk ki a VO2 és VCO2 értékek REE (kalória) értékekké való konvertálására. A REE mérések pontosságának biztosítása érdekében az átlagos légzési cserearányt is ellenőriztük a korábbi módszertan szerint.

VO2peak és 1RM felmérések A kiinduláskor minden résztvevőnél előszűrést végeztek annak megállapítására, hogy alkalmasak-e a VO2csúcs teszt elvégzésére a fizikai aktivitásra való felkészültségi kérdőív segítségével. Annak érdekében, hogy a résztvevők megismerjék a VO2peak tesztet, előzetesen részletes szóbeli leírást adtunk a protokollról. A protokoll egy 5 perces bemelegítést és egy kerékpározás ismerkedési időszakát foglalta magában egy Monark Ergomedic 839E-vel, Vansbro, Svédország. Következésképpen a teszt három perces pedálozást tartalmazott 60 fordulat/perc sebességgel 60 watton, majd 30 watt/perc növekményt az akaratlagos kimerülésig. A résztvevőkhöz automatizált gázanalizátort (Vmax, CareFusion, USA) csatlakoztattak, hogy 20 másodpercenként rögzítsék a légzési változókat. A legmagasabb oxigénfelvételt (milliliter/perc) bármely 20 másodperces intervallumban rögzítettük a végső VO2 csúcsértékként.

Az 1 RM lábnyújtást és a mellkasi nyomást a következőképpen teszteltük: Minden résztvevő számára megfelelő súlyt állítottunk be, hogy ne tudja 10 ismétlésnél tovább emelni. Ezután kiszámították az ismétlések számát, és egy normát használtak az 1 RM előrejelzésére, az egyes résztvevők által felemelt kilogrammokban kifejezett súly és az elvégzett ismétlések száma alapján.

A diéta értékelése A résztvevőket véletlenszerűen telefonon kerestük meg – egy független asszisztens által, aki nem volt elvakult a vizsgálat céljaitól – egy hét alatt három külön napon (két hétköznap, egy hétvégi napon) egy háromnapos diéta nyilvántartás elkészítése céljából. Az érintkezés napján elfogyasztott összes ételt és italt feljegyezték. A háromnapos étrendre vonatkozó feljegyzéseket az alapvonalon, a beavatkozás 8. és 16. hetében gyűjtöttük össze. Az összes diétarekordot egy másik képzett asszisztens elemezte, akit elvakított a tanulmány célja a Nutritionist Pro 5.4.0-s verziójával, Axxya Systems (Redmond, WA, USA). Ez a szoftver (pl. Nutritionist Pro) korábban kutatási célokra használták. Az elemzéshez a Nutritionist Pro alkalmazásban keresést végeztek minden elfogyasztott étel és ital esetében. Az egyes ételek és/vagy italok mennyiségére és elkészítésére vonatkozó részletek is szerepeltek. Miután az étellel vagy itallal kapcsolatos összes lényeges információt bevitték a szoftverbe, a megfelelő makro- és mikrotápanyag-tartalmak listája elkészült, majd elmentésre került. Ezt a folyamatot megismételték az étrendi nyilvántartásban szereplő összes étel és ital esetében. Ha egy adott étel vagy ital nem található a Nutritionist Pro adatbázisban, a vizsgáló manuálisan beírta az adott élelmiszer makro- és mikrotápanyag-tartalmát, és elmentette az adatbázisba későbbi felhasználás céljából. A szoftver által az egyes ételekre vagy italokra vonatkozó visszajelzések a következő étrendi változókat tartalmazták: teljes energiabevitel (kalória), élelmiszer tömege (grammatika), fehérje (grammatika), szénhidrát (grammatika), összes zsír (grammatika), teljes cukor (grammatika) nyelvtanok) és a koffein (mikrogrammatika).