Gli effetti dell'esercizio cronico sul gene UCP1 nel tessuto adiposo bianco umano

I ricercatori hanno ottenuto tre biopsie di grasso sottocutaneo (basale, post-esercizio, post-allenamento) da 32 uomini sani che hanno intrapreso tre diversi programmi di esercizio di otto settimane [aerobico (9 partecipanti), resistenza (8 partecipanti), combinato (aerobico+resistenza , 8 partecipanti)] e un gruppo di non esercizio (7 partecipanti), seguito da un periodo di deformazione di otto settimane. L'intensità dell'esercizio è stata fissata al 65% del consumo di picco di ossigeno (VO2peak) e 1 ripetizione massima (1RM) per tutto il periodo di esercizio, mentre il contenuto dei programmi di esercizio basato su uno studio precedente che ha esaminato il gene PGC1a, che si ritiene aumenti l'UCP1 nel tessuto adiposo bianco umano (WAT). Esercizio eseguito in tre palestre locali a Trikala, in Tessaglia, in Grecia, ciascuna per ogni gruppo di esercizi per evitare la contaminazione incrociata tra i partecipanti, mentre i supervisori degli esercizi erano all'oscuro dello scopo dello studio. Le misurazioni per l'antropometria, la composizione corporea, il dispendio energetico a riposo (REE) e la biopsia del grasso sottocutaneo sono state ottenute al basale, post-esercizio (settimana 8) e post-detraining (settimana 16) mentre i dati sulla dieta sono stati raccolti in modo casuale per due giorni della settimana e un giorno del fine settimana al basale, 8a e 16a settimana. VO2peak e 1RM sono stati misurati al basale, 4a (per regolare l'intensità dell'esercizio richiesta al 65%), 8a e 16a settimana.

Antropometria I partecipanti hanno visitato il laboratorio tra le 07:00 e le 09:00 e hanno preso parte alle seguenti misurazioni antropometriche: L'altezza è stata misurata utilizzando un dispositivo Seca (Amburgo, Germania) e il peso utilizzando una bilancia (KERN & Sohn GmbH, Versione 5.3, Germania ) mentre il rapporto vita-fianchi è stato misurato utilizzando un metro a nastro e la pressione sanguigna attraverso un metodo acustico utilizzando uno sfigmomanometro aneroide. La percentuale di grasso corporeo e la massa magra sono state misurate tramite impedenza bioelettrica utilizzando un monitor della composizione corporea (Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA D-61346 Bad Hamburg, Germania).

Biopsie adipose Tutte le biopsie sono state eseguite da un chirurgo esperto seguendo una metodologia precedente tramite un metodo non diatermico. I partecipanti sono stati sottoposti a biopsia del grasso sottocutaneo dopo almeno otto ore di digiuno e sono stati istruiti ad astenersi dall'esercizio fisico, dall'alcol e dal fumo passivo nelle 72 ore precedenti la procedura di biopsia al fine di ridurre al minimo il rischio di risultati fuorvianti. Ogni partecipante è stato posizionato su un letto chirurgico in posizione supina. Il sito dell'incisione è stato disinfettato e nella regione dell'incisione sono stati iniettati 10 ml di xylocaina 2% senza adrenalina per l'anestesia locale. Un'incisione sulla pelle e sul tessuto sottocutaneo fino alla scoperta del tessuto adiposo è stata eseguita a circa 3-5 centimetri vicino all'ombelico mentre la lunghezza dell'incisione era di circa 2-2,5 centimetri. Successivamente, il tessuto sottocutaneo è stato rimosso con una forbice operativa e quando il tessuto adiposo è diventato visibile sono stati catturati e rimossi quasi 500 milligrammi di tessuto adiposo. Il tessuto adiposo raccolto è stato immediatamente immerso in azoto liquido a -190° Celsius. Per la deposizione finale i campioni sono stati posti in Eppendorfs e sono stati depositati in un congelatore a -80° Celsius fino all'analisi.

Analisi dell'mRNA dell'UCP1 I ricercatori che hanno eseguito le analisi dell'espressione genica e proteica erano all'oscuro dello scopo dello studio. L'RNA totale è stato estratto dalle biopsie del tessuto adiposo utilizzando il mini kit RNeasy Lipid Tissue (QIAGEN) seguendo il protocollo del produttore. I cDNA del primo filamento sono stati sintetizzati da quantità uguali di RNA totale utilizzando primer casuali e trascrittasi inversa M-MLV (Promega). La reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale per il gene UCP1 è stata eseguita utilizzando il fluoroforo Sybr Green. La variazione di fluorescenza ad ogni ciclo è stata monitorata ed è stato calcolato un ciclo di soglia sopra lo sfondo per ciascuna reazione. Dopo ogni corsa è stata eseguita un'analisi della curva di fusione per garantire un singolo prodotto amplificato per ogni reazione. Tutte le reazioni sono state effettuate almeno in duplicato per ogni campione. Il gene 18S rRNA è stato costantemente espresso in tutte le condizioni sperimentali ed è stato quindi utilizzato come gene di riferimento per la normalizzazione dato che questo gene è stato suggerito come il più appropriato per la normalizzazione dell'mRNA di UCP1.

Analisi della proteina UCP1 Il tessuto adiposo sottocutaneo è stato omogeneizzato in RIPA Lysis Buffer con inibitori della proteasi (Sigma-Aldrich, Milano, Italia), centrifugato a 800 g per 10 minuti a 4° Celsius e poi è stato raccolto lo strato intermedio. Quantità uguali (50 microgrammi) di proteine ​​sono state separate su gel di poliacrilammide SDS al 10%, trasferite su una membrana di nitrocellulosa. UCP1 da campioni di tessuto adiposo sottocutaneo sono stati rilevati da anticorpi primari, rispettivamente anti-UCP1 umano policlonale di coniglio (1:1000, Sigma-Aldrich, Milano, Italia) e anti-β-actina monoclonale di topo (1:5000, Sigma-Aldrich, Milano, Italia). Gli anticorpi secondari erano IgG anti-coniglio coniugati con perossidasi per UCP1 e IgG anti-topo per β-actina. Gli adipociti umani trattati con mentolo 100uM sono stati utilizzati come controlli positivi per l'espressione della proteina UCP1 secondo la metodologia precedente. L'analisi Western blotting è stata eseguita utilizzando Immobilion Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore) e il rilevamento è stato effettuato utilizzando pellicole fotografiche. Le immagini sono state analizzate mediante densitometria, che valuta la quantità relativa di colorazione proteica e quantifica i risultati in termini di densità ottica.

Valutazioni REE Le valutazioni REE sono state condotte tra le 07:00 e le 09:00 dopo 12 ore di digiuno, mentre i partecipanti si sono astenuti dall'esercizio fisico, dall'alcol e dal fumo passivo nelle 72 ore precedenti le misurazioni. La REE è stata misurata utilizzando un analizzatore di gas automatico (Vmax, CareFusion, USA) collegato ai partecipanti per registrare le variabili respiratorie ogni 20 secondi in posizione supina per 30 minuti in una stanza tranquilla a 22-24° Celsius. Dai 30 minuti dei dati raccolti, sono stati rimossi i primi e gli ultimi cinque minuti. Infine, è stata calcolata la media dei restanti 20 minuti dei dati raccolti per ottenere il valore finale REE (calorie). Le misurazioni dei gas respiratori sono state estratte utilizzando l'equazione di Weir per convertire i valori VO2 e VCO2 in valori REE (calorie). Per garantire l'accuratezza delle misurazioni REE, è stato verificato anche il rapporto di scambio respiratorio medio secondo la metodologia precedente.

Valutazioni VO2peak e 1RM Al basale, è stato eseguito un pre-screening per ciascun partecipante per identificare la loro idoneità a sottoporsi a un test VO2peak utilizzando il Physical Activity Readiness Questionnaire. Per garantire la familiarizzazione dei partecipanti con il test VO2peak è stata fornita in anticipo una descrizione verbale dettagliata del protocollo. Il protocollo prevedeva un riscaldamento di cinque minuti e un periodo di familiarizzazione di un ciclismo su un Monark Ergomedic 839E, Vansbro, Svezia. Di conseguenza, il test prevedeva tre minuti di pedalata a 60 giri al minuto a 60 Watt seguiti da un incremento di 30 Watt/minuto fino all'esaurimento volontario. Ai partecipanti è stato collegato un analizzatore di gas automatico (Vmax, CareFusion, USA) per registrare le variabili respiratorie ogni 20 secondi. Il massimo consumo di ossigeno (millilitri/minuto) per ogni intervallo di 20 secondi è stato registrato come valore di picco finale di VO2.

L'1RM di leg extension e chest press è stato testato come segue: è stato regolato un peso adeguato per ogni partecipante in modo da non poterlo sollevare per non più di 10 ripetizioni. È stato quindi calcolato il numero delle ripetizioni ed è stata utilizzata una norma per prevedere l'1RM utilizzando il peso in chilogrammi sollevato da ciascun partecipante e il numero delle ripetizioni eseguite.

Valutazione della dieta I partecipanti sono stati contattati telefonicamente in modo casuale - da un assistente indipendente che non conosceva lo scopo dello studio - in tre giorni separati (due giorni feriali, un giorno del fine settimana) durante un periodo settimanale per il completamento di un registro della dieta di tre giorni. Sono stati registrati tutti i cibi e le bevande consumati il ​​giorno del contatto. I registri della dieta di tre giorni sono stati raccolti al basale, all'ottava e alla sedicesima settimana dell'intervento. Tutti i record dietetici sono stati analizzati da un altro assistente qualificato che era cieco allo scopo dello studio utilizzando Nutritionist Pro, versione 5.4.0, Sistemi Axxya (Redmond, WA, USA). Questo software (es. Nutritionist Pro) è stato precedentemente utilizzato per scopi di ricerca. Per l'analisi, è stata condotta una ricerca in Nutritionist Pro per ogni alimento e bevanda consumati. Sono stati inclusi anche i dettagli riguardanti la quantità e la preparazione di ciascun alimento e/o bevanda. Una volta inserite nel software tutte le informazioni rilevanti riguardanti l'alimento o la bevanda, è stato fornito e successivamente salvato un elenco corrispondente del contenuto di macro e micronutrienti. Questo processo è stato ripetuto per tutti gli alimenti e le bevande elencati nel registro della dieta. Se un particolare alimento o bevanda non è stato trovato nel database di Nutritionist Pro, l'investigatore ha inserito manualmente il contenuto di macro e micronutrienti di quel particolare alimento e lo ha salvato nel database per un uso futuro. Il feedback fornito dal software per ogni alimento o bevanda includeva le seguenti variabili dietetiche: apporto energetico totale (calorie), peso dell'alimento (grammatiche), proteine ​​(grammatiche), carboidrati (grammatiche), grassi totali (grammatiche), zucchero totale ( grammatiche) e caffeina (microgrammatiche).