Die Auswirkungen chronischer körperlicher Betätigung auf das UCP1-Gen im menschlichen weißen Fettgewebe

Die Forscher erhielten drei (Basislinie, nach dem Training, nach dem Training) subkutane Fettbiopsien von 32 gesunden Männern, die drei verschiedene achtwöchige Trainingsprogramme absolvierten [aerob (9 Teilnehmer), Widerstand (8 Teilnehmer), kombiniert (aerob + Widerstand , 8 Teilnehmer)] und eine Nicht-Übungsgruppe (7 Teilnehmer), gefolgt von einer achtwöchigen De-Training-Periode. Die Trainingsintensität wurde während des gesamten Trainingszeitraums auf 65 % des maximalen Sauerstoffverbrauchs (VO2peak) und 1 Wiederholungsmaximum (1RM) festgelegt, während der Inhalt der Trainingsprogramme auf einer früheren Studie basierte, in der das PGC1a-Gen untersucht wurde, von dem angenommen wird, dass es UCP1 erhöht im menschlichen weißen Fettgewebe (WAT). Die Übung wurde in drei örtlichen Fitnessstudios in Trikala, Thessalien, Griechenland, jeweils für jede Übungsgruppe durchgeführt, um eine Kreuzkontamination zwischen den Teilnehmern zu vermeiden, während die Übungsleiter für das Ziel der Studie blind waren. Messungen für Anthropometrie, Körperzusammensetzung, Ruheenergieverbrauch (REE) und subkutane Fettbiopsie wurden zu Studienbeginn, nach dem Training (Woche 8) und nach dem Training (Woche 16) durchgeführt, während die Ernährungsdaten zufällig an zwei Wochentagen und erhoben wurden ein Wochenendtag zu Studienbeginn, 8. und 16. Woche. VO2peak und 1RM wurden zu Studienbeginn, in der 4. (zur Anpassung der erforderlichen Trainingsintensität auf 65 %), in der 8. und 16. Woche gemessen.

Anthropometrie Die Teilnehmer besuchten das Labor zwischen 07:00 und 09:00 Uhr und nahmen an folgenden anthropometrischen Maßnahmen teil: Die Körpergröße wurde mit einem Gerät von Seca (Hamburg, Deutschland) und das Gewicht mit einer Waage (KERN & Sohn GmbH, Version 5.3, Deutschland) gemessen ), während das Verhältnis von Taille zu Hüfte mit einem Maßband und der Blutdruck durch eine akustische Methode mit einem Aneroid-Blutdruckmessgerät gemessen wurde. Der prozentuale Körperfettanteil und die fettfreie Masse wurden über bioelektrische Impedanz unter Verwendung eines Körperzusammensetzungsmonitors (Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA D-61346 Bad Hamburg, Deutschland) gemessen.

Fettbiopsien Alle Biopsien wurden von einem erfahrenen Chirurgen nach einer früheren Methodik über eine Nicht-Diathermie-Methode durchgeführt. Die Teilnehmer unterzogen sich nach mindestens achtstündigem Fasten einer subkutanen Fettbiopsie und wurden angewiesen, 72 Stunden vor dem Biopsieverfahren auf Sport, Alkohol und Passivrauchen zu verzichten, um das Risiko irreführender Ergebnisse zu minimieren. Jeder Teilnehmer wurde in Rückenlage auf einem Operationsbett positioniert. Die Stelle des Einschnitts wurde desinfiziert und 10 ml Xylocain 2% ohne Adrenalin wurden in den Bereich des Einschnitts zur Lokalanästhesie injiziert. Ein Einschnitt auf der Haut und dem subkutanen Gewebe, bis Fettgewebe freigelegt war, wurde ungefähr 3–5 cm in der Nähe des Nabels ausgeführt, während die Einschnittlänge ungefähr 2–2,5 cm betrug. Anschließend wurde das subkutane Gewebe mit einer Operationsschere entfernt und als das Fettgewebe sichtbar wurde, wurden fast 500 Milligramm Fettgewebe eingefangen und entfernt. Das gesammelte Fettgewebe wurde sofort in flüssigen Stickstoff von –190° Celsius getaucht. Für die endgültige Deponierung wurden die Proben in Eppendorfs gelegt und bis zur Analyse in einem Gefrierschrank bei -80° Celsius gelagert.

UCP1-mRNA-Analyse Die Forscher, die die Gen- und Proteinexpressionsanalysen durchführten, waren bezüglich des Ziels der Studie verblindet. Die Gesamt-RNA wurde aus Fettgewebebiopsien unter Verwendung des RNeasy Lipid Tissue Mini Kit (QIAGEN) gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert. Erststrang-cDNAs wurden aus gleichen Mengen an Gesamt-RNA unter Verwendung von Zufallsprimern und M-MLV-reverser Transkriptase (Promega) synthetisiert. Eine quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion für das UCP1-Gen wurde unter Verwendung von Sybr Green Fluorophor durchgeführt. Die Veränderung der Fluoreszenz bei jedem Zyklus wurde überwacht und ein Schwellenzyklus über dem Hintergrund für jede Reaktion wurde berechnet. Nach jedem Lauf wurde eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt, um sicherzustellen, dass für jede Reaktion ein einzelnes amplifiziertes Produkt vorliegt. Alle Reaktionen wurden für jede Probe mindestens doppelt durchgeführt. Das 18S-rRNA-Gen wurde unter allen experimentellen Bedingungen konstant exprimiert und wurde dann als Referenzgen für die Normalisierung verwendet, da dieses Gen als das geeignetste für die Normalisierung von UCP1-mRNA vorgeschlagen wurde.

UCP1-Proteinanalyse Subkutanes Fettgewebe wurde in RIPA-Lysepuffer mit Proteaseinhibitoren (Sigma-Aldrich, Mailand, Italien) homogenisiert, bei 800 g für 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert und dann wurde die Mittelschicht gesammelt. Gleiche Mengen (50 Mikrogramm) Proteine ​​wurden auf 10 % SDS-Polyacrylamidgel getrennt und auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. UCP1 aus subkutanen Fettgewebeproben wurde durch Primärantikörper, polyklonales Kaninchen-Anti-Human-UCP1 (1:1000, Sigma-Aldrich, Mailand, Italien) bzw. Maus-monoklonales Anti-Human-β-Aktin (1:5000, Sigma-Aldrich, Mailand, Italien). Sekundäre Antikörper waren Peroxidase-konjugiertes Anti-Kaninchen-IgG für UCP1 und Anti-Maus-IgG für β-Aktin. Humane Adipozyten, die mit 100 uM Menthol behandelt wurden, wurden gemäß der vorherigen Methodik als positive Kontrollen für die UCP1-Proteinexpression verwendet. Die Western-Blotting-Analyse wurde unter Verwendung von Immobilion Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore) durchgeführt, und die Detektion erfolgte unter Verwendung von fotografischen Filmen. Die Bilder wurden durch Densitometrie analysiert, die die relative Menge der Proteinfärbung auswertet und die Ergebnisse in Bezug auf die optische Dichte quantifiziert.

REE-Bewertungen REE-Bewertungen wurden zwischen 07:00 und 09:00 Uhr nach 12 Stunden Fasten durchgeführt, während die Teilnehmer 72 Stunden vor den Messungen auf Sport, Alkohol und Passivrauchen verzichteten. REE wurde mit einem automatisierten Gasanalysator (Vmax, CareFusion, USA) gemessen, der an den Teilnehmern befestigt war, um alle 20 Sekunden Atemvariablen in Rückenlage für 30 Minuten in einem ruhigen Raum bei 22-24° Celsius aufzuzeichnen. Von den 30 Minuten der gesammelten Daten wurden die ersten und letzten fünf Minuten entfernt. Schließlich wurden die verbleibenden 20 Minuten der gesammelten Daten gemittelt, um den endgültigen REE-Wert (Kalorien) zu erhalten. Atemgasmessungen wurden unter Verwendung der Weir-Gleichung extrahiert, um VO2- und VCO2-Werte in REE-Werte (Kalorien) umzuwandeln. Um die Genauigkeit der REE-Messungen sicherzustellen, wurde auch das durchschnittliche Atemaustauschverhältnis gemäß der früheren Methodik verifiziert.

VO2peak- und 1RM-Bewertungen Zu Studienbeginn wurde für jeden Teilnehmer ein Vorscreening durchgeführt, um seine Eignung zur Durchführung eines VO2peak-Tests mithilfe des Fragebogens zur Bereitschaft für körperliche Aktivität zu ermitteln. Um die Vertrautheit der Teilnehmer mit dem VO2peak-Test sicherzustellen, wurde vorab eine ausführliche mündliche Beschreibung des Protokolls gegeben. Das Protokoll umfasste ein fünfminütiges Aufwärmen und eine Eingewöhnungsphase beim Radfahren in einem Monark Ergomedic 839E, Vansbro, Schweden. Folglich beinhaltete der Test ein dreiminütiges Treten mit 60 Umdrehungen pro Minute bei 60 Watt, gefolgt von einer Steigerung von 30 Watt/Minute bis zur willentlichen Erschöpfung. Ein automatisierter Gasanalysator (Vmax, CareFusion, USA) wurde an den Teilnehmern angebracht, um alle 20 Sekunden respiratorische Variablen aufzuzeichnen. Die höchste Sauerstoffaufnahme (Milliliter/Minute) für ein beliebiges 20-Sekunden-Intervall wurde als endgültiger VO2-Spitzenwert aufgezeichnet.

Das 1RM Beinstrecker und Brustpresse wurden wie folgt getestet: Für jeden Teilnehmer wurde ein passendes Gewicht eingestellt, um es nicht mehr als 10 Wiederholungen heben zu können. Die Anzahl der Wiederholungen wurde dann berechnet und eine Norm wurde verwendet, um das 1RM vorherzusagen, wobei das Gewicht in Kilogramm, das jeder Teilnehmer hob, und die Anzahl der ausgeführten Wiederholungen verwendet wurden.

Ernährungsbeurteilung Die Teilnehmer wurden nach dem Zufallsprinzip von einem unabhängigen Assistenten, dem das Ziel der Studie nicht bekannt war, an drei verschiedenen Tagen (zwei Wochentage, ein Wochenendtag) während einer Woche telefonisch kontaktiert, um eine dreitägige Ernährungsaufzeichnung zu erstellen. Alle am Tag des Kontakts verzehrten Speisen und Getränke wurden aufgezeichnet. Zu Studienbeginn, in der 8. und 16. Woche der Intervention wurden dreitägige Ernährungsprotokolle erhoben. Alle Ernährungsaufzeichnungen wurden von einem anderen geschulten Assistenten analysiert, der das Ziel der Studie mit Nutritionist Pro, Version 5.4.0, verblindet hatte. Axxya Systems (Redmond, WA, USA). Diese Software (z. Nutritionist Pro) wurde zuvor für Forschungszwecke verwendet. Für die Analyse wurde in Nutritionist Pro nach jedem konsumierten Lebensmittel und Getränk gesucht. Details zur Menge und Zubereitung jedes Essens und/oder Getränks waren ebenfalls enthalten. Nachdem alle relevanten Informationen zum Lebensmittel oder Getränk in die Software eingegeben wurden, wurde eine entsprechende Liste der Makro- und Mikronährstoffgehalte erstellt und anschließend gespeichert. Dieser Vorgang wurde für alle im Ernährungsprotokoll aufgeführten Speisen und Getränke wiederholt. Wenn ein bestimmtes Lebensmittel oder Getränk nicht in der Nutritionist Pro-Datenbank gefunden wurde, gab der Ermittler den Makro- und Mikronährstoffgehalt dieses bestimmten Lebensmittels manuell ein und speicherte ihn zur späteren Verwendung in der Datenbank. Das von der Software bereitgestellte Feedback für jedes Lebensmittel oder Getränk umfasste die folgenden Ernährungsvariablen: Gesamtenergieaufnahme (Kalorien), Gewicht des Lebensmittels (Grammatik), Protein (Grammatik), Kohlenhydrate (Grammatik), Gesamtfett (Grammatik), Gesamtzucker ( Grammatiken) und Koffein (Mikrogrammatiken).