Effekterne af kronisk træning på UCP1-genet i humant hvidt fedtvæv

Efterforskerne opnåede tre (baseline, post-motion, post-de-træning) subkutane fedtbiopsier fra 32 raske mænd, som gennemførte tre forskellige otte ugers træningsprogrammer [aerobe (9 deltagere), modstand (8 deltagere), kombineret (aerob+resistens). , 8 deltagere)] og en ikke-træningsgruppe (7 deltagere), efterfulgt af en otte ugers aftræningsperiode. Træningsintensiteten blev sat til 65 % af maksimalt iltforbrug (VO2peak) og 1 gentagelsesmaksimum (1RM) i hele træningsperioden, mens indholdet af træningsprogrammerne var baseret på en tidligere undersøgelse, der undersøgte PGC1a-genet, som menes at øge UCP1 i humant hvidt fedtvæv (WAT). Træning udført i tre lokale fitnesscentre i Trikala, Thessalien, Grækenland, hver for hver træningsgruppe for at undgå krydskontaminering mellem deltagerne, mens træningsvejlederne blev blindet for formålet med undersøgelsen. Målinger for antropometri, kropssammensætning, hvileenergiforbrug (REE) og subkutan fedtbiopsi blev opnået ved baseline, efter træning (uge 8) og efter aftræning (uge 16), mens kostdata blev tilfældigt indsamlet for to hverdage og en weekenddag ved baseline, 8. og 16. uge. VO2peak og 1RM blev målt ved baseline, 4. (for at justere den nødvendige træningsintensitet til 65%), 8. og 16. uge.

Antropometri Deltagerne besøgte laboratoriet mellem kl. 07:00 og 09:00, og følgende antropometriske mål deltog: Højde blev målt ved hjælp af en Seca (Hamburg, Tyskland) enhed og vægt ved hjælp af en vægt (KERN & Sohn GmbH, Version 5.3, Tyskland ), mens talje-til-hofte-forholdet blev målt ved hjælp af et målebånd og blodtryk ved hjælp af en akustisk metode ved anvendelse af et aneroid-sfygmomanometer. Procent kropsfedt og fedtfri masse blev målt via bioelektrisk impedans ved hjælp af en kropssammensætningsmonitor (Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA D-61346 Bad Hamburg, Tyskland).

Fedtbiopsier Alle biopsier blev udført af en erfaren kirurg efter en tidligere metode via en ikke-diatermimetode. Deltagerne gennemgik en subkutan fedtbiopsi efter mindst otte timers faste, og de blev instrueret i at afstå fra motion, alkohol og passiv rygning i 72 timer før biopsiproceduren for at minimere risikoen for vildledende resultater. Hver deltager blev placeret på en kirurgisk seng i liggende stilling. Stedet for snittet blev desinficeret, og 10 ml xylocain 2%-ingen adrenalin blev injiceret i området for snittet til lokalbedøvelse. Et snit på huden og subkutant væv, indtil fedtvæv blev afsløret, blev udført ca. 3-5 centimeter i nærheden af ​​navlen, mens incisionslængden var ca. 2-2,5 centimeter. Efterfølgende blev det subkutane væv fjernet med en operationssaks, og da fedtvævet blev synligt blev næsten 500 milligram fedtvæv fanget og fjernet. Det opsamlede fedtvæv blev straks nedsænket i flydende nitrogen på -190° Celsius. Til den endelige deponering blev prøverne placeret i Eppendorfs, og de blev deponeret i en fryser ved -80° Celsius indtil analyser.

UCP1 mRNA-analyse De efterforskere, der udførte gen- og proteinekspressionsanalyserne, var blindet for formålet med undersøgelsen. Totalt RNA blev ekstraheret fra fedtvævsbiopsier under anvendelse af RNeasy Lipid Tissue minikit (QIAGEN) efter producentens protokol. Første-strengs cDNA'er blev syntetiseret fra lige store mængder af totalt RNA under anvendelse af tilfældige primere og M-MLV revers transkriptase (Promega). Kvantitativ realtidspolymerasekædereaktion for UCP1-genet blev udført under anvendelse af Sybr Green-fluorofor. Ændringen i fluorescens ved hver cyklus blev overvåget, og en tærskelcyklus over baggrunden for hver reaktion blev beregnet. En smeltekurveanalyse blev udført efter hver kørsel for at sikre et enkelt amplificeret produkt for hver reaktion. Alle reaktioner blev udført i mindst duplikater for hver prøve. 18S rRNA-genet blev konstant udtrykt under alle eksperimentelle betingelser og blev derefter brugt som referencegen til normalisering, da dette gen blev foreslået som det mest passende til normalisering af UCP1-mRNA.

UCP1-proteinanalyse Subkutant fedtvæv blev homogeniseret i RIPA-lysebuffer med proteaseinhibitorer (Sigma-Aldrich, Milano, Italien), centrifugeret ved 800 g i 10 minutter ved 4°C, og derefter blev det midterste lag opsamlet. Lige store mængder (50 mikrogram) af proteiner blev separeret på 10% SDS-polyacrylamidgel, overført til en nitrocellulosemembran. UCP1 fra subkutane fedtvævsprøver blev påvist af primære antistoffer, henholdsvis kanin polyklonal anti-human UCP1 (1:1000, Sigma-Aldrich, Milano, Italien) og muse monoklonal anti-human β-actin (1:5000, Sigma-Aldrich, Milano, Italien). Sekundære antistoffer var peroxidase-konjugeret anti-kanin IgG for UCP1 og anti-muse IgG for β-actin. Humane adipocytter, der blev behandlet med 100 uM menthol, blev brugt som positive kontroller for UCP1-proteinekspression ifølge tidligere metodologi. Western blotting-analyse blev udført under anvendelse af Immobilion Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore), og detektion blev foretaget ved anvendelse af fotografiske film. Billederne er blevet analyseret ved densitometri, som evaluerer den relative mængde af proteinfarvning og kvantificerer resultaterne i form af optisk tæthed.

REE-vurderinger REE-vurderinger blev udført mellem kl. 07.00 og 09.00 efter 12 timers faste, mens deltagerne afstod fra motion, alkohol og passiv rygning i 72 timer før målingerne. REE blev målt ved hjælp af en automatiseret gasanalysator (Vmax, CareFusion, USA), der var knyttet til deltagerne for at registrere respiratoriske variabler hvert 20. sekund i liggende stilling i 30 minutter i et stille rum på 22-24° Celsius. Fra de 30 minutter af de indsamlede data blev de første og sidste fem minutter fjernet. Endelig blev de resterende 20 minutter af de indsamlede data beregnet som gennemsnit for at opnå den endelige REE-værdi (kalorier). Åndedrætsgasmålinger blev ekstraheret ved hjælp af Weir-ligningen for at konvertere VO2- og VCO2-værdier til REE-værdier (kalorier). For at sikre nøjagtigheden af ​​REE-målingerne blev det gennemsnitlige respiratoriske udvekslingsforhold også verificeret i henhold til tidligere metodologi.

VO2peak og 1RM-vurderinger Ved baseline blev der udført en præ-screening for hver deltager for at identificere deres berettigelse til at gennemføre en VO2peak-test ved hjælp af Physical Activity Readiness Questionnaire. For at sikre deltagernes fortrolighed med VO2peak-testen blev der på forhånd givet en detaljeret verbal beskrivelse af protokollen. Protokollen involverede en fem minutters opvarmning og en fortrolighedsperiode af en cykling i en Monark Ergomedic 839E, Vansbro, Sverige. Som følge heraf involverede testen tre minutters pedalkørsel med 60 omdrejninger i minuttet ved 60 watt efterfulgt af en stigning på 30 watt/minut indtil frivillig udmattelse. En automatiseret gasanalysator (Vmax, CareFusion, USA) blev knyttet til deltagerne for at registrere respiratoriske variabler hvert 20. sekund. Den højeste iltoptagelse (milliliter/minut) for ethvert 20 sekunders interval blev registreret som den endelige VO2-peakværdi.

1RM af benforlængelse og brystpres blev testet som følger: En passende vægt blev justeret for hver deltager for ikke at kunne løfte den i mere end 10 gentagelser. Antallet af gentagelser blev derefter beregnet, og en norm blev brugt til at forudsige 1RM ved hjælp af vægten i kilogram, som hver deltager løftede, og antallet af gentagelser, der blev udført.

Kostvurdering Deltagerne blev tilfældigt kontaktet telefonisk - af en uafhængig assistent, der var blindet for formålet med undersøgelsen - på tre separate dage (to hverdage, en weekenddag) i løbet af en uges periode med henblik på færdiggørelsen af ​​en tre-dages kostjournal. Al mad og drikkevarer indtaget på kontaktdagen blev registreret. Tre-dages kostregistreringer blev indsamlet ved baseline, 8. og 16. uge efter interventionen. Alle kostregistre blev analyseret af en anden uddannet assistent, som var blindet for formålet med undersøgelsen ved hjælp af Nutritionist Pro, Version 5.4.0, Axxya Systems (Redmond, WA, USA). Denne software (dvs. Nutritionist Pro) er tidligere blevet brugt til forskningsformål. Til analysen blev der foretaget en søgning i Nutritionist Pro for hver indtaget mad og drikkevare. Detaljer vedrørende mængden og tilberedning af hver mad og/eller drikkevare var også inkluderet. Når alle relevante oplysninger om maden eller drikkevaren var indtastet i softwaren, blev en tilsvarende liste over makro- og mikronæringsstofindhold tilvejebragt og efterfølgende gemt. Denne proces blev gentaget for alle mad- og drikkevarer, der er anført i kostjournalen. Hvis en bestemt mad eller drikkevare ikke blev fundet i Nutritionist Pro-databasen, indtastede efterforskeren manuelt makro- og mikronæringsstofindholdet i den pågældende fødevare og gemte det i databasen til fremtidig brug. Feedbacken fra softwaren for hver mad eller drikkevare inkluderede følgende diætvariabler: samlet energiindtag (kalorier), vægt af mad (grammatikker), protein (grammatikker), kulhydrat (grammatikker), totalt fedt (grammatikker), totalt sukker ( grammatikker) og koffein (mikrogrammatikker).