Effekterna av kronisk träning på UCP1-genen i mänsklig vit fettvävnad

Utredarna erhöll tre (baslinje, efter träning, efter träning) subkutana fettbiopsier från 32 friska män som genomförde tre olika åtta veckors träningsprogram [aerobic (9 deltagare), motstånd (8 deltagare), kombinerad (aerobic+resistens) , 8 deltagare)] och en icke-träningsgrupp (7 deltagare), följt av en åtta veckors avträningsperiod. Träningsintensiteten sattes till 65 % av maximal syreförbrukning (VO2peak) och 1 repetitionsmax (1RM) under hela träningsperioden, medan innehållet i träningsprogrammen baserades på en tidigare studie som undersökte PGC1a-genen, som tros öka UCP1 i mänsklig vit fettvävnad (WAT). Träning utfördes i tre lokala gym i Trikala, Thessalien, Grekland, var och en för varje träningsgrupp för att undvika korskontaminering mellan deltagarna, medan träningsledarna var blinda för syftet med studien. Mätningar för antropometri, kroppssammansättning, viloenergiförbrukning (REE) och subkutan fettbiopsi erhölls vid baslinjen, efter träning (vecka 8) och efter avträning (vecka 16) medan kostdata samlades in slumpmässigt under två vardagar och en helgdag vid baslinjen, 8:e och 16:e veckan. VO2peak och 1RM mättes vid baslinjen, 4:e (för att justera den nödvändiga träningsintensiteten vid 65%), 8:e och 16:e veckan.

Antropometri Deltagarna besökte laboratoriet mellan 07:00 och 09:00 och följande antropometriska mätningar deltog: Höjd mättes med en Seca (Hamburg, Tyskland) apparat och vikt med hjälp av en våg (KERN & Sohn GmbH, Version 5.3, Tyskland ) medan midja-till-höft-förhållandet mättes med hjälp av ett måttband och blodtryck genom en akustisk metod med användning av en aneroid blodtrycksmätare. Procent kroppsfett och fettfri massa mättes via bioelektrisk impedans med hjälp av en kroppssammansättningsmonitor (Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA D-61346 Bad Hamburg, Tyskland).

Fettbiopsier Alla biopsier utfördes av en erfaren kirurg enligt en tidigare metod via en icke-diatermimetod. Deltagarna genomgick en subkutan fettbiopsi efter minst åtta timmars fasta och de instruerades att avstå från träning, alkohol och passiv rökning 72 timmar före biopsiproceduren för att minimera risken för missvisande resultat. Varje deltagare placerades på en kirurgisk säng i ryggläge. Snittet desinficerades och 10 ml xylokain 2%-ingen adrenalin injicerades i området för snittet för lokalbedövning. Ett snitt på huden och subkutan vävnad tills fettvävnad avslöjades gjordes cirka 3-5 centimeter nära naveln medan snittets längd var cirka 2-2,5 centimeter. Därefter avlägsnades den subkutana vävnaden med en operationssax och när fettvävnaden blev synlig infångades och avlägsnades nästan 500 milligram fettvävnad. Den uppsamlade fettvävnaden nedsänktes omedelbart i flytande kväve på -190° Celsius. För den slutliga deponeringen placerades proverna i Eppendorfs och de deponerades i en frys vid -80° Celsius fram till analyser.

UCP1 mRNA-analys Utredarna som utförde gen- och proteinuttrycksanalyserna var blinda för syftet med studien. Totalt RNA extraherades från fettvävnadsbiopsier med användning av RNeasy Lipid Tissue mini kit (QIAGEN) enligt tillverkarens protokoll. Första-strängs cDNA syntetiserades från lika mängder totalt RNA med användning av slumpmässiga primrar och M-MLV omvänt transkriptas (Promega). Kvantitativ realtidspolymeraskedjereaktion för UCP1-genen utfördes med användning av Sybr Green-fluorofor. Förändringen i fluorescens vid varje cykel övervakades och en tröskelcykel över bakgrunden för varje reaktion beräknades. En smältkurvanalys utfördes efter varje körning för att säkerställa en enda amplifierad produkt för varje reaktion. Alla reaktioner utfördes i åtminstone duplikat för varje prov. 18S rRNA-genen uttrycktes konstant under alla experimentella förhållanden och användes sedan som en referensgen för normalisering med tanke på att denna gen föreslogs som den mest lämpliga för normalisering av UCP1-mRNA.

UCP1-proteinanalys Subkutan fettvävnad homogeniserades i RIPA-lysbuffert med proteashämmare (Sigma-Aldrich, Milano, Italien), centrifugerades vid 800 g i 10 minuter vid 4°C och sedan samlades mellanskiktet upp. Lika mängder (50 mikrogram) proteiner separerades på 10% SDS-polyakrylamidgel, överfördes till ett nitrocellulosamembran. UCP1 från subkutana fettvävnadsprover detekterades av primära antikroppar, respektive kanin polyklonalt anti-humant UCP1 (1:1000, Sigma-Aldrich, Milano, Italien) och musmonoklonalt anti-humant β-aktin (1:5000, Sigma-Aldrich, Milano, Italien). Sekundära antikroppar var peroxidaskonjugerad anti-kanin-IgG för UCP1 och anti-mus-IgG för β-aktin. Humana adipocyter som behandlats med 100 uM mentol användes som positiva kontroller för UCP1-proteinuttryck enligt tidigare metodik. Western blotting-analys utfördes med Immobilion Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore) och detektion gjordes med hjälp av fotografiska filmer. Bilderna har analyserats med densitometri, som utvärderar den relativa mängden proteinfärgning och kvantifierar resultaten i termer av optisk densitet.

REE-bedömningar REE-bedömningar genomfördes mellan 07:00 och 09:00 efter 12 timmars fasta, medan deltagarna avstod från träning, alkohol och passiv rökning 72 timmar före mätningarna. REE mättes med en automatiserad gasanalysator (Vmax, CareFusion, USA) som fästes på deltagarna för att registrera andningsvariabler var 20:e sekund i ryggläge under 30 minuter i ett tyst rum med 22-24° Celsius. Från de 30 minuterna av den insamlade datan togs de första och sista fem minuterna bort. Slutligen beräknades medelvärdet för de återstående 20 minuterna av de insamlade data för att erhålla det slutliga REE-värdet (kalorier). Andningsgasmätningar extraherades med hjälp av Weir-ekvationen för att omvandla VO2- och VCO2-värden till REE-värden (kalorier). För att säkerställa noggrannheten av REE-mätningarna verifierades också det genomsnittliga respiratoriska utbytesförhållandet enligt tidigare metodik.

VO2peak och 1RM-bedömningar Vid baslinjen gjordes en förscreening för varje deltagare för att identifiera deras behörighet att genomföra ett VO2peak-test med hjälp av Physical Activity Readiness Questionnaire. För att säkerställa deltagarnas bekantskap med VO2peak-testet gavs en detaljerad verbal beskrivning av protokollet i förväg. Protokollet innebar en fem minuters uppvärmning och en bekantskapsperiod av en cykling i en Monark Ergomedic 839E, Vansbro, Sverige. Följaktligen involverade testet tre minuters trampning med 60 varv per minut vid 60 watt följt av ett steg på 30 watt/minut tills avsiktlig utmattning. En automatiserad gasanalysator (Vmax, CareFusion, USA) kopplades till deltagarna för att registrera andningsvariabler var 20:e sekund. Det högsta syreupptaget (milliliter/minut) för varje 20 sekunders intervall registrerades som det slutliga VO2-toppvärdet.

1RM för benförlängning och bröstpress testades enligt följande: En lämplig vikt justerades för varje deltagare för att inte kunna lyfta den i högst 10 repetitioner. Antalet repetitioner beräknades sedan och en norm användes för att förutsäga 1RM med hjälp av vikten i kilogram som varje deltagare lyfte och antalet repetitioner som utfördes.

Dietbedömning Deltagarna kontaktades slumpmässigt per telefon - av en oberoende assistent som var blind för syftet med studien - på tre separata dagar (två vardagar, en helgdag) under en veckoperiod för att slutföra en tredagars dietjournal. All mat och dryck som konsumerades på kontaktdagen registrerades. Tredagars dietposter samlades in vid baslinjen, 8:e och 16:e veckan av interventionen. Alla dietposter analyserades av en annan utbildad assistent som var blind för syftet med studien med Nutritionist Pro, version 5.4.0, Axxya Systems (Redmond, WA, USA). Denna programvara (dvs. Nutritionist Pro) har tidigare använts för forskningsändamål. För analysen gjordes en sökning i Nutritionist Pro för varje mat och dryck som konsumerades. Detaljer om mängden och beredningen av varje mat och/eller dryck inkluderades också. När all relevant information om maten eller drycken matats in i programvaran, tillhandahölls en motsvarande lista med innehåll av makro- och mikronäringsämnen och sparades sedan. Denna process upprepades för all mat och dryck som anges i kostjournalen. Om en viss mat eller dryck inte hittades i Nutritionist Pro-databasen, matade utredaren manuellt in makro- och mikronäringsämneinnehållet i just den maten och sparade det i databasen för framtida användning. Feedbacken från programvaran för varje mat eller dryck inkluderade följande kostvariabler: totalt energiintag (kalorier), matens vikt (grammatik), protein (grammatik), kolhydrater (grammatik), totalt fett (grammatik), totalt socker ( grammatik) och koffein (mikrogrammatik).