Wpływ chronicznych ćwiczeń na gen UCP1 w ludzkiej białej tkance tłuszczowej

Badacze uzyskali trzy (wyjściowe, powysiłkowe i powysiłkowe) biopsje podskórnej tkanki tłuszczowej od 32 zdrowych mężczyzn, którzy podjęli trzy różne ośmiotygodniowe programy ćwiczeń [aerobowy (9 uczestników), oporowy (8 uczestników), połączony (aerobowy + oporowy). , 8 uczestników)] i grupie niećwiczącej (7 uczestników), po której nastąpił ośmiotygodniowy okres przestoju. Intensywność ćwiczeń została ustalona na poziomie 65% szczytowego zużycia tlenu (VO2peak) i 1 maksimum powtórzeń (1RM) w całym okresie ćwiczeń, podczas gdy treść programów ćwiczeń opierała się na poprzednim badaniu, w którym zbadano gen PGC1a, który, jak się uważa, zwiększa UCP1 w ludzkiej białej tkance tłuszczowej (WAT). Ćwiczenia przeprowadzono w trzech lokalnych salach gimnastycznych w Trikala, Tesalia, Grecja, każda dla każdej grupy ćwiczącej, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego między uczestnikami, podczas gdy osoby nadzorujące ćwiczenia były ślepe na cel badania. Pomiary antropometrii, składu ciała, spoczynkowego wydatku energetycznego (REE) i biopsji podskórnej tkanki tłuszczowej uzyskano w okresie wyjściowym, po wysiłku (tydzień 8) i po zakończeniu treningu (tydzień 16), podczas gdy dane dotyczące diety były zbierane losowo przez dwa dni powszednie i jeden dzień weekendu na początku badania, 8. i 16. tydzień. VO2peak i 1RM mierzono na początku, 4. (w celu dostosowania wymaganej intensywności ćwiczeń do 65%), 8. i 16. tygodnia.

Antropometria Uczestnicy odwiedzili laboratorium w godzinach od 07:00 do 09:00 i wzięli udział w następujących pomiarach antropometrycznych: Pomiar wysokości za pomocą urządzenia Seca (Hamburg, Niemcy) oraz masy ciała za pomocą wagi (KERN & Sohn GmbH, wersja 5.3, Niemcy) ), podczas gdy stosunek talii do bioder mierzono za pomocą taśmy mierniczej, a ciśnienie krwi metodą akustyczną za pomocą sfigmomanometru aneroidowego. Procent tkanki tłuszczowej i masę beztłuszczową mierzono za pomocą impedancji bioelektrycznej przy użyciu monitora składu ciała (Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA D-61346 Bad Hamburg, Niemcy).

Biopsje tkanki tłuszczowej Wszystkie biopsje zostały wykonane przez doświadczonego chirurga zgodnie z poprzednią metodologią, metodą bez diatermii. Uczestnicy przeszli biopsję podskórnej tkanki tłuszczowej po co najmniej ośmiogodzinnym poście i zostali poinstruowani, aby powstrzymać się od ćwiczeń, alkoholu i biernego palenia na 72 godziny przed procedurą biopsji, aby zminimalizować ryzyko błędnych wyników. Każdy uczestnik został umieszczony na łóżku chirurgicznym w pozycji leżącej. Miejsce nacięcia zdezynfekowano i wstrzyknięto w okolicę nacięcia 10 ml ksylokainy 2% bez adrenaliny w celu znieczulenia miejscowego. Nacięcie skóry i tkanki podskórnej, aż do ujawnienia się tkanki tłuszczowej, wykonywano około 3-5 centymetrów w pobliżu pępka, a długość nacięcia wynosiła około 2-2,5 centymetra. Następnie tkankę podskórną usunięto nożyczkami operacyjnymi, a gdy tkanka tłuszczowa stała się widoczna, zebrano i usunięto prawie 500 miligramów tkanki tłuszczowej. Pobraną tkankę tłuszczową natychmiast zanurzono w ciekłym azocie o temperaturze -190°C. W celu ostatecznego osadzania próbki umieszczono w Eppendorfach i umieszczono w zamrażarce w temperaturze -80°C do czasu analizy.

Analiza mRNA UCP1 Badacze, którzy przeprowadzili analizy ekspresji genów i białek, byli zaślepieni co do celu badania. Całkowity RNA ekstrahowano z biopsji tkanki tłuszczowej przy użyciu minizestawu RNeasy Lipid Tissue (QIAGEN) zgodnie z protokołem producenta. cDNA pierwszej nici zsyntetyzowano z równych ilości całkowitego RNA przy użyciu losowych starterów i odwrotnej transkryptazy M-MLV (Promega). Ilościową reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym dla genu UCP1 przeprowadzono przy użyciu fluoroforu Sybr Green. Monitorowano zmianę fluorescencji w każdym cyklu i obliczano cykl progowy powyżej tła dla każdej reakcji. Analizę krzywej topnienia przeprowadzano po każdym przebiegu, aby zapewnić pojedynczy zamplifikowany produkt dla każdej reakcji. Wszystkie reakcje przeprowadzono w co najmniej dwóch powtórzeniach dla każdej próbki. Gen 18S rRNA był stale eksprymowany we wszystkich warunkach eksperymentalnych, a następnie był używany jako gen referencyjny do normalizacji, biorąc pod uwagę, że gen ten został zasugerowany jako najbardziej odpowiedni do normalizacji mRNA UCP1.

Analiza białka UCP1 Podskórną tkankę tłuszczową homogenizowano w buforze RIPA Lysis Buffer z inhibitorami proteazy (Sigma-Aldrich, Mediolan, Włochy), wirowano przy 800 g przez 10 minut w temperaturze 4°C, a następnie zebrano warstwę środkową. Równe ilości (50 mikrogramów) białek rozdzielono na 10% żelu SDS-poliakryloamidowym, przeniesiono na membranę nitrocelulozową. UCP1 z próbek podskórnej tkanki tłuszczowej wykryto przeciwciałami pierwotnymi, odpowiednio króliczymi poliklonalnymi anty-ludzkimi UCP1 (1:1000, Sigma-Aldrich, Mediolan, Włochy) i mysimi monoklonalnymi anty-ludzkimi β-aktyną (1:5000, Sigma-Aldrich, Mediolan, Włochy). Drugorzędowymi przeciwciałami były skoniugowane z peroksydazą anty-królicze IgG dla UCP1 i anty-mysie IgG dla β-aktyny. Ludzkie adipocyty traktowane 100 uM mentolem zastosowano jako kontrolę pozytywną dla ekspresji białka UCP1 zgodnie z poprzednią metodologią. Analizę Western blotting przeprowadzono stosując Immobilion Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore), a detekcję przeprowadzono stosując klisze fotograficzne. Obrazy zostały przeanalizowane za pomocą densytometrii, która ocenia względną ilość wybarwienia białka i określa ilościowo wyniki pod względem gęstości optycznej.

Oceny REE Oceny REE przeprowadzono między 07:00 a 09:00 po 12 godzinach postu, podczas gdy uczestnicy powstrzymywali się od ćwiczeń fizycznych, alkoholu i biernego palenia w ciągu 72 godzin przed pomiarami. REE mierzono za pomocą automatycznego analizatora gazów (Vmax, CareFusion, USA), który był podłączony do uczestników w celu rejestrowania zmiennych oddechowych co 20 sekund w pozycji leżącej przez 30 minut w cichym pomieszczeniu o temperaturze 22-24°C. Z 30 minut zebranych danych usunięto pierwsze i ostatnie pięć minut. Na koniec pozostałe 20 minut zebranych danych uśredniono w celu uzyskania ostatecznej wartości REE (kalorii). Pomiary gazów oddechowych zostały wyodrębnione przy użyciu równania Weira w celu przeliczenia wartości VO2 i VCO2 na wartości REE (kalorie). Aby zapewnić dokładność pomiarów REE, średni współczynnik wymiany oddechowej został również zweryfikowany zgodnie z wcześniejszą metodologią.

Ocena VO2peak i 1RM Na początku każdego uczestnika przeprowadzono wstępną selekcję w celu określenia, czy kwalifikuje się do wykonania testu VO2peak za pomocą kwestionariusza gotowości do aktywności fizycznej. Aby zapewnić zapoznanie uczestników z testem VO2peak, z góry podano szczegółowy słowny opis protokołu. Protokół obejmował pięciominutową rozgrzewkę i okres zapoznawczy z jazdą na rowerze w Monark Ergomedic 839E, Vansbro, Szwecja. W rezultacie test obejmował trzy minuty pedałowania z prędkością 60 obrotów na minutę przy 60 watach, a następnie zwiększanie o 30 watów na minutę, aż do wolicjonalnego wyczerpania. Zautomatyzowany analizator gazów (Vmax, CareFusion, USA) został podłączony do uczestników w celu rejestrowania zmiennych oddechowych co 20 sekund. Najwyższy pobór tlenu (mililitry/minutę) dla dowolnego 20-sekundowego interwału rejestrowano jako końcową wartość szczytową VO2.

1RM wyprostu nogi i wyciskania na klatkę piersiową testowano w następujący sposób: Dla każdego uczestnika dostosowano odpowiednią wagę, aby nie był w stanie podnieść jej przez nie więcej niż 10 powtórzeń. Następnie obliczono liczbę powtórzeń i zastosowano normę do przewidywania 1RM na podstawie wagi w kilogramach, którą podniósł każdy uczestnik, oraz liczby wykonanych powtórzeń.

Ocena diety Z uczestnikami losowo kontaktowano się telefonicznie - przez niezależnego asystenta, który nie był świadomy celu badania - w trzy oddzielne dni (dwa dni powszednie, jeden dzień weekendowy) w okresie tygodnia w celu uzupełnienia trzydniowego zapisu diety. Rejestrowano wszystkie posiłki i napoje spożywane w dniu kontaktu. Zapisy diety z trzech dni zbierano na początku badania, w 8. i 16. tygodniu interwencji. Wszystkie zapisy dotyczące diety zostały przeanalizowane przez innego przeszkolonego asystenta, który nie znał celu badania, używając programu Nutritionist Pro, wersja 5.4.0, Axxya Systems (Redmond, Waszyngton, USA). To oprogramowanie (tj. Nutritionist Pro) był wcześniej używany do celów badawczych. Na potrzeby analizy przeprowadzono wyszukiwanie w Nutritionist Pro dla każdego spożywanego jedzenia i napoju. Uwzględniono również szczegóły dotyczące ilości i przygotowania każdego jedzenia i/lub napoju. Po wprowadzeniu do oprogramowania wszystkich istotnych informacji dotyczących żywności lub napojów, dostarczana była odpowiednia lista zawartości makro- i mikroskładników odżywczych, a następnie zapisywana. Proces ten powtórzono dla wszystkich produktów spożywczych i napojów wymienionych w zapisie diety. Jeśli w bazie danych Nutritionist Pro nie znaleziono określonej żywności lub napoju, badacz ręcznie wprowadził zawartość makro- i mikroskładników odżywczych w tej konkretnej żywności i zapisał ją w bazie danych do wykorzystania w przyszłości. Informacje zwrotne dostarczone przez oprogramowanie dla każdego jedzenia lub napoju obejmowały następujące zmienne dietetyczne: całkowite spożycie energii (kalorie), waga jedzenia (gramatyki), białko (gramatyki), węglowodany (gramatyki), całkowity tłuszcz (gramatyki), całkowity cukier ( gramatyki) i kofeiny (mikrogramatyki).