SEPticショックにおけるPLateletsアセチル-CoAカルボキシラーゼリン酸化状態 (PLACCSEPS)

バックグラウンド

感染に反応して起こる全身性炎症反応である敗血症は、主要な公衆衛生上の問題であり、集中治療室 (ICU) での主な死因として認識されています。 この重度の炎症反応は、内皮の活性化と機能不全を引き起こします。 この現象は、内皮細胞表面での組織因子 (TF) の露出を介した凝固カスケードの活性化と密接に関連しています。 TF は、凝固因子 VII および X のアンカーとして機能し、凝固因子を活性化します。 これにより、トロンビン (IIa) が生成され、フィブリンが生成されます。

トロンビンは、血小板の活性化と消費をもたらす強力な血小板アゴニスト（活性化因子）でもあります。 敗血症中の活性化血小板の凝固促進活性は、臓器灌流を損ない、死に至る可能性がある微小血栓症の形成を促進します。 血小板減少症は一般的であり、敗血症性ショック患者の強力な陰性予後マーカーです。

凝固を超えて、血小板は炎症および免疫応答において重要な役割を果たすことが知られています。 血小板の活性化は、炎症を起こした内皮または循環炎症性サイトカインによって開始される可能性があり、これが炎症反応および血栓反応を調節します。 活性化された血小板は、好中球などの免疫細胞と相互作用します。 さらに、血小板は、Toll-Like Receptors (TLR) ファミリーのメンバーを発現し、いくつかの感染病原体からリガンドを結合することにより、微生物の「センサー」として機能することができます。 最近のデータは、血小板と好中球の細胞外トラップ (NET) との間の相互作用を強調しています。 血小板はNETの形成を促進し、逆にNETは血小板を活性化します。 NET は、血小板、血栓症、免疫応答、および炎症を結び付けているため、敗血症の状況では特に興味深いものです。

血小板は、脂質生成の最初の段階の酵素であるアセチル CoA カルボキシラーゼ 1 (ACC1) を発現します。 AMP 活性化プロテインキナーゼ (AMPK) によるセリン 79 の ACC リン酸化はその阻害につながり、AMPK はトロンビンによって活性化されます。 AMPK-ACC軸が血小板のリン脂質含有量を制御し、TXA2と高密度顆粒の放出、そして血栓形成に影響を与えることを実証しました。 TXA2 は、アラキドン酸 (AA) を含むリン脂質から生成されます。 あるいは、AA はリポオキシゲナーゼ (LOX) 経路によって代謝され、リポキシン (LX) とレゾルビンを生成します。これらはむしろ炎症の解消に関与しています。 AMPK-ACC シグナル伝達とリポオキシゲナーゼ経路との関係は調査されていません。

研究仮説

敗血症中のトロンビン生成の劇的な増加を知っている私たちの研究仮説は、血小板のAMPK誘導ACCリン酸化が増加し、これが血小板代謝、特にAAと脂質に由来する血小板炎症性メディエーターの内容を調節する可能性があるというものです.

患者の選択

ブリュッセルの Cliniques universitaires Saint-Luc に入院した敗血症性ショックの連続患者が含まれます (実験グループ)。

対照群は、敗血症のために ICU に入院した患者のレトロスペクティブ分析に基づいて、年齢と性別が一致する健康なボランティアに対応します。

探索的対照群は、重度の感染症および重度の全身性炎症反応の証拠なしに集中治療室に入院した患者に対応します。 神経障害や中毒患者が対象となります。

同様の除外基準は、実験群よりも対照群で同じになります。

材料と方法

研究の種類 前向き、単一中心、介入研究。

採血 血液サンプルは、静脈カテーテル挿入後、敗血症性ショックの診断後 48 時間以内に採取されます。

手順中に次のサンプルが採取されます。

• (INR、TCA、TT、PTT、フィブリノーゲン、DDimers) を含む凝固 (3 ml の 1 つの緑色のチューブ)
• マルチプレート分析 (3 ml のオレンジ TUBE 1 本)
• 血小板タンパク質分析用の血液サンプル (ACC リン酸化を含む)。 血小板を分離した後、残りの血漿を凍結します (8.5 ml の 2 TUBES CPDA)。
• 尿サンプル。

データ収集 データは、Medical Explorer および Q Care から収集されます。これには、血小板数、CRP レベル、凝固評価、腎機能、および肝酵素として ICU に入院した患者で日常的に実行される生物学的データが含まれます。 フォローアップは少なくとも3年間実施され、追加の訪問は計画されません。 フォローアップ期間中に記録されたイベントは、Medical Explorer から取得され、データが欠落している場合は電話がかけられます。

測定

• 血小板を含む血球数。
• ウエスタンブロッティング、ECLIAによるACCリン酸化。
• タンパク質アセチル化のための血小板タンパク質抽出物。
• マルチプレート分析を使用したエクスビボでの血小板機能。
• 血漿サンプリング。
• 血小板リピドミクス分析。 ACCリン酸化分析
• 血漿が豊富な血小板 (PRP) は、遠心分離後に得られます。 調製中の血小板の活性化を制限するために、アピラーゼとインテグリリンが添加されます。 PRPを3つのサンプルに分け、400gで10分間遠心分離した後、血小板をペレット化します。
• 3 つの血小板サンプルの 1 つを Lemli 溶液で溶解し、リン酸化 ACC、ACC1、およびリン酸化プロテインキナーゼ C 基質のウエスタンブロット分析を行います。 すべてのサンプルは、-80 ° c で保存されます。 異なるイムノブロッティングを比較するために、トロンビン刺激後に対照血小板サンプルを取得します。 各患者の血小板サンプルは、同じ対照サンプルと比較されます。 各患者のリン酸化 ACC のシグナルは、Image J (Rasband, WS, ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2014) であり、コントロール サンプル シグナルの割合として表されます。
• リン酸化ACCのレベルは、電気化学発光（ECLIA、Meso Scale Discovery）およびフローサイトメトリー（FACS）によって確認されます。
• タンパク質抽出物は、イムノブロッティングを使用した血小板タンパク質分析に使用されます。

血漿採取

• INR、TCA、TT、PTT、フィブリノゲン、D-ダイマー、トロンビン アンチトロンビン複合体 (TAT) などの凝固マーカー。
• サイトカイン測定 (TNF-α、IL-1b、IL-6、ケモカイン - CCL 3、5、および 18、補体系) および炎症性バイオマーカー (過敏性 C 反応性タンパク質)。
• 血小板活性化バイオマーカー (sCD62P、sCD40L、CD62P、PF4) (Dr C. Oury、GIGA、Université de Liège、ベルギーとの共同研究)。
• 線溶バイオマーカー (u-PA、t-PA、PAI)。
• リピドミック。 尿 TX2B 生成を測定するために採血と同じ時間に尿のサンプルを収集します。

リピドーム分析 リピドームは、Montréal Heart Insitute の Christine Des Rosiers と共同で分析されます。 COX および LOX 経路からの代謝物 (TXA2 およびリポキシン) に特別な注意が払われます。

サンプルサイズ

予備データに基づいて、最小 46 人の患者の登録により、ACC のリン酸化で 0.15 の差 (対照群 1 と敗血症性ショック集団の差) を検出するために、5% の有意水準で 90% の検出力が得られると判断しました。 . 探索的対照群では20人の患者が予想されます。

Covid-19 - 研究の修正

2019 年 12 月以降、コロナウイルス病 2019 (COVID-19) を引き起こす新しい重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) は、中国での流行の発生からパンデミックに発展しました。 重度の感染症は主に両側性肺炎の原因ですが、新たなデータは、それが造血および免疫系を含む複数のシステムを含む全身性疾患であることを示しています。 内皮の活性化、凝固促進状態、および微小血栓症が示されています。 しかし、病態生理が細菌性敗血症に類似しているとは証明されておらず、上記の代謝経路は Covid-19 患者のサブグループでも研究されるべきです。

Covid-19 グループは、SARS-Cov-2 感染および PaO2/FiO2 < 200 による ARDS で ICU に入院した患者に対応します。 包含は入院後5日以内に行われ、細菌の同時感染のある患者は除外されます。 対照群および敗血症性ショック群と同様に、46 人の患者を登録する予定でした。