Krevní destičky Stav fosforylace acetyl-CoA karboxylázy při septickém šoku (PLACCSEPS)

Pozadí

Sepse, systémová zánětlivá reakce vyskytující se v reakci na infekci, je hlavním problémem veřejného zdraví a je uznávána jako hlavní příčina úmrtí na jednotce intenzivní péče (JIP). Tato závažná zánětlivá reakce způsobuje aktivaci a dysfunkci endotelu. Tento jev je úzce spojen s aktivací koagulační kaskády prostřednictvím expozice tkáňového faktoru (TF) na povrchu endoteliálních buněk. TF slouží jako kotva pro faktory koagulace VII a X umožňující jejich aktivaci. To má za následek tvorbu trombinu (IIa) a tvorbu fibrinu.

Trombin je také silný agonista krevních destiček (aktivátor), který vede k aktivaci a spotřebě krevních destiček. Prokoagulační aktivita aktivovaných krevních destiček během sepse zvyšuje tvorbu mikrotrombózy, která zhoršuje perfuzi orgánů a může vést ke smrti. Trombocytopenie je častá a je silným negativním prognostickým markerem u pacientů se septickým šokem.

Kromě koagulace je známo, že krevní destičky hrají klíčovou roli při zánětu a imunitní odpovědi. Aktivace krevních destiček může být iniciována zaníceným endotelem nebo cirkulačními zánětlivými cytokiny, které zase modulují zánětlivou a trombotickou odpověď. Aktivované krevní destičky interagují s imunitními buňkami, jako jsou neutrofily. Kromě toho mohou krevní destičky působit jako mikrobiální "senzory" tím, že exprimují členy rodiny Toll-Like Receptors (TLRs), váží ligandy z několika infekčních agens. Nedávná data zdůrazňují souhru mezi trombocyty a neutrofily extracelulární pasti (NET). Krevní destičky usnadňují tvorbu NETs a naopak NETS krevní destičky aktivují. NET spojují krevní destičky, trombózu, imunitní odpověď a zánět, a proto jsou zvláště zajímavé v septickém kontextu.

Krevní destičky exprimují acetyl-CoA karboxylázu 1 (ACC1), což je enzym prvního kroku lipogeneze. ACC fosforylace na serinu 79 AMP-aktivovanou proteinkinázou (AMPK) vede k její inhibici a AMPK je aktivován trombinem. Prokázali jsme, že osa AMPK-ACC řídí obsah fosfolipidů krevních destiček, které ovlivňují uvolňování TXA2 a hustých granulí a následně tvorbu trombu. TXA2 je generován z fosfolipidů obsahujících kyselinu arachidonovou (AA). Alternativně může být AA metabolizován cestou lipooxygenázy (LOX) produkující lipoxiny (LX) a resolvin, které se spíše podílejí na řešení zánětu. Vztah mezi AMPK-ACC signalizací a lipooxygenázovou dráhou nebyl nikdy zkoumán.

Výzkumná hypotéza

S vědomím dramatického zvýšení tvorby trombinu během sepse je naší výzkumnou hypotézou, že AMPK-indukovaná ACC fosforylace v krevních destičkách je zvýšená a že to může modulovat metabolismus krevních destiček a konkrétněji obsah zánětlivých mediátorů krevních destiček pocházejících z AA a lipidů.

Výběr pacientů

Budou zahrnuti po sobě jdoucí pacienti se septickým šokem přijatí na Cliniques universitaires Saint-Luc v Bruselu (experimentální skupina)

Kontrolní skupina bude odpovídat zdravým dobrovolníkům stejného věku a pohlaví na základě retrospektivní analýzy pacientů přijatých na JIP pro sepsi.

Průzkumná kontrolní skupina bude odpovídat pacientům přijatým na jednotku intenzivní péče bez známek závažné infekce a závažné systémové zánětlivé reakce. Cílovou populací budou pacienti s neurologickou poruchou a intoxikací.

Podobná vylučovací kritéria budou stejná v kontrolních skupinách jako v experimentální skupině.

materiály a metody

Typ studie Prospektivní, monocentrická, intervenční studie.

Odběr krve Vzorky krve budou odebrány po zavedení žilního katétru do 48 hodin po diagnóze septického šoku.

Během procedury budou odebrány následující vzorky:

• Koagulace včetně (INR, TCA, TT, PTT, fibrinogen, DDimery) (1 zelená tuba 3 ml)
• Analýza na více destičkách (1 oranžová zkumavka o objemu 3 ml)
• Vzorek krve pro analýzu proteinů krevních destiček (včetně fosforylace ACC). Po izolaci krevních destiček bude zbývající plazma zmražena (2 TUBES CPDA po 8,5 ml).
• Vzorek moči.

Sběr dat Data budou shromažďována z Medical Explorer a Q Care, včetně biologických dat, která jsou rutinně prováděna u pacientů přijatých na JIP, jako je počet krevních destiček, hladina CRP, hodnocení koagulace, funkce ledvin a jaterní enzymologie. Sledování bude prováděno minimálně 3 roky a nebudou plánovány žádné další návštěvy. Události zaznamenané během období sledování budou získány z Medical Explorer a v případě chybějících dat bude zavolán.

Měření

• Počet krvinek včetně krevních destiček.
• ACC fosforylace přes western blot, ECLIA.
• Proteinový extrakt z krevních destiček pro acetylaci bílkovin.
• Funkce krevních destiček ex vivo pomocí multiplate analýzy.
• Odběr vzorků plazmy.
• Lipidomická analýza krevních destiček. ACC fosforylační analýza
• Po centrifugaci se získají krevní destičky bohaté na plazmu (PRP). Apyráza a Integrilin se přidávají k omezení aktivace krevních destiček během přípravy. PRP se rozdělí na 3 vzorky a destičky se peletují po centrifugaci při 400 g po dobu 10 minut.
• Jeden ze 3 vzorků krevních destiček bude lyžován roztokem Lemli pro analýzu Western blot fosforylovaných substrátů ACC, ACC1 a fosforylované proteinkinázy C. Všechny vzorky pak budou skladovány při -80°C. Aby bylo možné porovnat různé imunoblotingy, byly po stimulaci trombinem získány kontrolní vzorky krevních destiček. Vzorek krevních destiček každého pacienta bude porovnán se stejným kontrolním vzorkem. Signál fosforylovaného ACC pro každého pacienta bude kvantifikován pomocí obrázku J (Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2014) a bude vyjádřen jako zlomek signálu kontrolního vzorku.
• Úroveň fosforylovaného ACC bude potvrzena elektrochemiluminiscencí (ECLIA, Meso Scale Discovery) a průtokovou cytometrií (FACS).
• Proteinové extrakty budou použity pro analýzu proteinů krevních destiček pomocí imunoblotu.

Odběr vzorků plazmy

• Koagulační markery zahrnující INR, TCA, TT, PTT, fibrinogen, D-dimery, trombinový antitrombinový komplex (TAT).
• Měření cytokinů (TNF-alfa, IL-1b, IL-6, chemokiny-CCL 3, 5 a 18, systém komplementu) a také zánětlivých biomarkerů (hypersenzitivní C-reaktivní protein).
• Biomarkery aktivace krevních destiček (sCD62P, sCD40L, CD62P, PF4) (spolupráce s Dr. C. Ourym, GIGA, Université de Liège, Belgie).
• Fibrinolytické biomarkery (u-PA, t-PA a PAI).
• Lipidomický. Moč Vzorky moči budou odebírány ve stejných časech jako odběr krve pro měření generace TX2B.

Lipidomické analýzy Lipidom bude analyzován ve spolupráci s Christine Des Rosiers v Montreal Heart Insitute. Zvláštní pozornost bude věnována metabolitům z drah COX a LOX (TXA2 a lipoxiny).

Velikost vzorku

Na základě našich předběžných údajů jsme určili, že zařazení minimálně 46 pacientů by poskytlo sílu 90 % na hladině významnosti 5 % k detekci rozdílu 0,15 ve fosforylaci ACC (rozdíl mezi kontrolní skupinou 1 a populací septického šoku). . V explorativní kontrolní skupině se očekává 20 pacientů.

Covid-19 – Dodatek studie

Od prosince 2019 se nový závažný akutní respirační syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) způsobující onemocnění Coronavirus 2019 (COVID-19) vyvinul z epidemie v Číně v pandemii. Závažná infekce je zodpovědná hlavně za bilaterální pneumonii, ale nově vznikající údaje naznačují, že se jedná o systémové onemocnění zahrnující více systémů včetně hematopoetického a imunitního systému. Byla prokázána aktivace endotelu, prokoagulační stav a mikrotrombóza. Nebylo však prokázáno, že by patofyziologie byla podobná bakteriální sepsi a výše zmíněná metabolická dráha by měla být studována také u podskupiny pacientů s Covid-19.

Skupina Covid-19 bude odpovídat pacientům přijatým na JIP s ARDS kvůli infekci SARS-Cov-2 a PaO2/FiO2 < 200. Zařazení bude provedeno do 5 dnů po přijetí a pacienti s bakteriální koinfekcí budou vyloučeni. Plánovali jsme zařadit 46 pacientů, podobně jako u kontrolní skupiny a skupiny se septickým šokem.