Verihiutaleet asetyyli-CoA-karboksylaasifosforylaatiotila septisessä shokissa (PLACCSEPS)

Tausta

Sepsis, systeeminen tulehdusreaktio, joka ilmenee vasteena infektiolle, on suuri kansanterveysongelma, ja se tunnustetaan yleisimmäksi kuolinsyyksi tehohoitoyksikössä (ICU). Tämä vakava tulehdusreaktio aiheuttaa endoteelin aktivaatiota ja toimintahäiriöitä. Tämä ilmiö liittyy läheisesti koagulaatiokaskadin aktivoitumiseen altistumalla kudostekijälle (TF) endoteelisolujen pinnalla. TF toimii ankkurina hyytymistekijöille VII ja X mahdollistaen niiden aktivoitumisen. Tämä johtaa trombiinin (IIa) muodostumiseen ja fibriinin tuotantoon.

Trombiini on myös voimakas verihiutaleiden agonisti (aktivaattori), joka johtaa verihiutaleiden aktivaatioon ja kulutukseen. Aktivoituneiden verihiutaleiden hyytymistä edistävä aktiivisuus sepsiksen aikana lisää mikrotromboosien muodostumista, mikä heikentää elinten perfuusiota ja voi johtaa kuolemaan. Trombosytopenia on yleinen ja vahva negatiivinen ennustemarkkeri septisellä sokkipotilailla.

Hyytymisen lisäksi verihiutaleilla tiedetään olevan keskeinen rooli tulehduksessa ja immuunivasteessa. Verihiutaleaktivaation voivat käynnistää tulehtunut endoteeli tai verenkierron tulehdussytokiinit, jotka puolestaan ​​moduloivat tulehdus- ja tromboottista vastetta. Aktivoidut verihiutaleet ovat vuorovaikutuksessa immuunisolujen, kuten neutrofiilien, kanssa. Lisäksi verihiutaleet voivat toimia mikrobien "sensoreina" ekspressoimalla Toll-Like Receptors (TLRs) -perheen jäseniä, jotka sitovat ligandeja useista tartunta-aineista. Viimeaikaiset tiedot korostavat verihiutaleiden ja neutrofiilien ekstrasellulaaristen ansojen (NET) välistä vuorovaikutusta. Verihiutaleet helpottavat NET:ien muodostumista ja päinvastoin NETS aktivoivat verihiutaleita. NET-verkot yhdistävät verihiutaleita, tromboosia, immuunivastetta ja tulehdusta ja ovat siksi erityisen kiinnostavia septisessä yhteydessä.

Verihiutaleet ekspressoivat asetyyli-CoA-karboksylaasi 1:tä (ACC1), joka on lipogeneesin ensimmäinen vaihe. AMP-aktivoidun proteiinikinaasin (AMPK) aiheuttama ACC-fosforylaatio seriini 79:ssä johtaa sen estoon ja trombiini aktivoi AMPK:n. Osoitimme, että AMPK-ACC-akseli säätelee verihiutaleiden fosfolipidipitoisuutta, mikä vaikuttaa TXA2:n ja tiheiden rakeiden vapautumiseen ja puolestaan ​​veritulpan muodostumiseen. TXA2 muodostuu arakidonihappoa (AA) sisältävistä fosfolipideistä. Vaihtoehtoisesti AA voidaan metaboloida lipo-oksigenaasireitin (LOX) avulla, joka tuottaa lipoksiineja (LX) ja resolviinia, jotka ovat pikemminkin mukana tulehduksen ratkaisemisessa. AMPK-ACC-signaloinnin ja lipo-oksigenaasireitin välistä suhdetta ei ole koskaan tutkittu.

Tutkimushypoteesi

Kun tiedämme trombiinin muodostumisen dramaattisen lisääntymisen sepsiksen aikana, tutkimushypoteesimme on, että AMPK:n aiheuttama ACC-fosforylaatio verihiutaleissa lisääntyy ja että tämä saattaa moduloida verihiutaleiden aineenvaihduntaa ja erityisesti verihiutaleiden tulehduksellisia välittäjäaineita, jotka tulevat AA:sta ja lipideistä.

Potilaiden valinta

Mukaan otetaan peräkkäiset septistä sokkia sairastavat potilaat Cliniques universitaires Saint-Lucissa, Brysselissä (kokeellinen ryhmä)

Kontrolliryhmä vastaa terveitä vapaaehtoisia, joiden ikä ja sukupuoli ovat samat, sepsiksen vuoksi teho-osastolle otettujen potilaiden retrospektiivisen analyysin perusteella.

Tutkiva kontrolliryhmä vastaa potilaita, jotka on otettu teho-osastolle ilman todisteita vakavasta infektiosta ja vakavasta systeemisestä tulehdusvasteesta. Kohdeväestönä ovat potilaat, joilla on neurologisia häiriöitä ja myrkytys.

Samanlaiset poissulkemiskriteerit ovat samat kontrolliryhmissä kuin koeryhmässä.

materiaali ja metodit

Tutkimuksen tyyppi Prospektiivinen, yksikeskinen, interventiotutkimus.

Verinäytteet Verinäytteet otetaan laskimokatetrin asettamisen jälkeen 48 tunnin kuluessa septisen sokin diagnoosista.

Toimenpiteen aikana otetaan seuraavat näytteet:

• Koagulaatio mukaan lukien (INR, TCA, TT, PTT, fibrinogeeni, DDimeerit) (1 vihreä TUBE 3 ml)
• Monilevyanalyysi (1 oranssi 3 ml PUTKI)
• Verinäyte verihiutaleiden proteiinianalyysiä varten (mukaan lukien ACC-fosforylaatio). Verihiutaleiden eristämisen jälkeen jäljellä oleva plasma jäädytetään (2 PUTKUA CPDA:ta 8,5 ml).
• Virtsanäyte.

Tiedonkeruu Tiedot kerätään Medical Explorerista ja Q Caresta, mukaan lukien biologiset tiedot, jotka suoritetaan rutiininomaisesti teho-osastolle saapuville potilaille, kuten verihiutaleiden määrä, CRP-taso, hyytymisarviointi, munuaisten toiminta ja maksan entsymologia. Seuranta suoritetaan vähintään 3 vuoden kuluttua, eikä lisäkäyntejä suunniteta. Seurantajakson aikana tallennetut tapahtumat hankitaan Medical Explorerista ja tiedot puuttuvat puhelimitse.

Mitat

• Verisolujen määrä, mukaan lukien verihiutaleet.
• ACC-fosforylaatio Western blot -menetelmällä, ECLIA.
• Verihiutaleproteiiniuute proteiinien asetylointiin.
• Verihiutaleiden toiminta ex vivo käyttämällä monilevyanalyysiä.
• Plasmanäytteenotto.
• Verihiutaleiden lipidomiikan analyysi. ACC-fosforylaatioanalyysi
• Plasmarikas verihiutale (PRP) saadaan sentrifugoinnin jälkeen. Apyrase ja Integrilin lisätään rajoittamaan verihiutaleiden aktivaatiota valmistuksen aikana. PRP jaetaan kolmeen näytteeseen ja verihiutaleet pelletoidaan sentrifugoinnin jälkeen 400 g 10 minuutin ajan.
• Yksi kolmesta verihiutalenäytteestä lyysataan Lemli-liuoksella fosforyloitujen ACC-, ACC1- ja fosforyloitujen proteiinikinaasi C -substraattien Western blot -analyysiä varten. Kaikki näytteet varastoidaan sitten -80 °C:seen. Erilaisten immunoblottausten vertaamiseksi verrokkiverihiutalenäytteet otetaan trombiinistimulaation jälkeen. Jokaisen potilaan verihiutalenäytettä verrataan samaan kontrollinäytteeseen. Fosforyloidun ACC:n signaali kullekin potilaalle kvantifioidaan Image J:llä (Rasband, W.S., ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2014) ja ilmaistaan ​​murto-osana kontrollinäytesignaalista.
• Fosforyloidun ACC:n taso varmistetaan elektrokemiluminesenssilla (ECLIA, Meso Scale Discovery) ja virtaussytometrillä (FACS).
• Proteiiniuutteita käytetään verihiutaleiden proteiinianalyysissä immunoblottauksella.

Plasmanäytteenotto

• Koagulaatiomarkkerit mukaan lukien INR, TCA, TT, PTT, fibrinogeeni, D-dimeerit, trombiiniantitrombiinikompleksi (TAT).
• Sytokiinimittaukset (TNF-alfa, IL-1b, IL-6, kemokiinit - CCL 3, 5 ja 18, komplementtijärjestelmä) sekä tulehdukselliset biomarkkerit (yliherkkä C-reaktiivinen proteiini).
• Verihiutaleaktivaatiobiomarkkerit (sCD62P, sCD40L, CD62P, PF4) (yhteistyössä Dr. C. Ouryn kanssa, GIGA, Université de Liège, Belgia).
• Fibrinolyyttiset biomarkkerit (u-PA, t-PA ja PAI).
• Lipidomic. Virtsat Virtsanäytteet otetaan samoihin aikoihin kuin verinäytteet TX2B-sukupolven mittaamiseksi.

Lipidomiset analyysit Lipidome analysoidaan yhteistyössä Christine Des Rosiersin kanssa Montréal Heart Instituessa. Erityistä huomiota kiinnitetään COX- ja LOX-reittien metaboliitteihin (TXA2 ja lipoksiinit).

Otoskoko

Alustavien tietojemme perusteella päätimme, että vähintään 46 potilaan rekisteröinti antaisi 90 %:n tehon 5 %:n merkitsevyystasolla havaitsemaan 0,15:n eron ACC:n fosforylaatiossa (ero kontrolliryhmän 1 ja septisen shokin populaation välillä) . Tutkivaan kontrolliryhmään odotetaan 20 potilasta.

Covid-19 - Tutkimusmuutos

Joulukuusta 2019 lähtien uusi koronavirustauti 2019 (COVID-19) aiheuttava vakava akuutti hengitystieoireyhtymä Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) on kehittynyt Kiinan epidemiaepidemiasta pandemiaksi. Vaikea infektio on pääasiallisesti vastuussa kahdenvälisestä keuhkokuumeesta, mutta uusien tietojen mukaan se on systeeminen sairaus, johon liittyy useita järjestelmiä, mukaan lukien hematopoieettinen ja immuunijärjestelmä. Endoteelin aktivaatio, prokoagulanttitila ja mikrotromboosi on osoitettu. Patofysiologian ei kuitenkaan ole osoitettu olevan samanlainen kuin bakteerisepsis, ja edellä mainittua aineenvaihduntareittiä tulisi tutkia myös Covid-19-potilaiden alaryhmässä.

Covid-19-ryhmä vastaa teho-osastolle SARS-Cov-2-infektion vuoksi ARDS-potilaita ja PaO2/FiO2 < 200. Sisällys tehdään 5 päivän kuluessa vastaanotosta, ja potilaat, joilla on bakteeri-infektio, suljetaan pois. Suunnittelimme ottamaan mukaan 46 potilasta, samoin kuin kontrolli- ja septisen shokin ryhmässä.