Plättchen-Acetyl-CoA-Carboxylase-Phosphorylierungszustand bei septischem Schock (PLACCSEPS)

Hintergrund

Sepsis, eine systemische Entzündungsreaktion, die als Reaktion auf eine Infektion auftritt, ist ein großes Problem der öffentlichen Gesundheit und wird als häufigste Todesursache auf der Intensivstation (ICU) anerkannt. Diese schwere Entzündungsreaktion verursacht eine endotheliale Aktivierung und Dysfunktion. Dieses Phänomen ist eng mit der Aktivierung der Gerinnungskaskade über die Exposition von Gewebefaktor (TF) an der Endothelzelloberfläche verbunden. TF dient als Anker für die Gerinnungsfaktoren VII und X und ermöglicht deren Aktivierung. Dies führt zur Bildung von Thrombin (IIa) und Fibrinproduktion.

Thrombin ist auch ein potenter Thrombozytenagonist (Aktivator), der zu einer Aktivierung und einem Verbrauch von Thrombozyten führt. Die gerinnungsfördernde Aktivität aktivierter Blutplättchen während einer Sepsis verstärkt die Bildung von Mikrothrombosen, die die Organdurchblutung beeinträchtigen und zum Tod führen können. Thrombozytopenie ist häufig und ein stark negativer prognostischer Marker bei Patienten mit septischem Schock.

Abgesehen von der Blutgerinnung spielen Blutplättchen bekanntermaßen eine Schlüsselrolle bei Entzündungen und der Immunantwort. Die Blutplättchenaktivierung kann durch entzündetes Endothel oder zirkulatorische entzündliche Zytokine initiiert werden, die wiederum die entzündliche und thrombotische Reaktion modulieren. Aktivierte Blutplättchen interagieren mit Immunzellen wie Neutrophilen. Darüber hinaus können Blutplättchen als mikrobielle "Sensoren" fungieren, indem sie Mitglieder der Familie der Toll-Like-Rezeptoren (TLRs) exprimieren und Liganden von mehreren Infektionserregern binden. Jüngste Daten unterstreichen das Zusammenspiel zwischen Blutplättchen und extrazellulären Fallen (NETs) von Neutrophilen. Blutplättchen erleichtern die Bildung von NETs und umgekehrt aktivieren NETS Blutplättchen. NETs verbinden Blutplättchen, Thrombose, Immunantwort und Entzündung und sind daher im septischen Kontext von besonderem Interesse.

Blutplättchen exprimieren Acetyl-CoA-Carboxylase 1 (ACC1), das Enzym der ersten Stufe der Lipogenese. ACC-Phosphorylierung an Serin 79 durch AMP-aktivierte Proteinkinase (AMPK) führt zu dessen Hemmung und AMPK wird durch Thrombin aktiviert. Wir haben gezeigt, dass die AMPK-ACC-Achse den Gehalt an Thrombozyten-Phospholipiden kontrolliert, die die Freisetzung von TXA2 und dichter Granula und damit die Thrombusbildung beeinflussen. TXA2 wird aus Phospholipiden erzeugt, die Arachidonsäure (AA) enthalten. Alternativ kann AA über den Lipooxygenase (LOX)-Weg metabolisiert werden, wodurch Lipoxine (LX) und Resolvin produziert werden, die eher an der Auflösung von Entzündungen beteiligt sind. Die Beziehung zwischen dem AMPK-ACC-Signalweg und dem Lipooxygenase-Weg wurde nie untersucht.

Forschungshypothese

In Kenntnis des dramatischen Anstiegs der Thrombinbildung während der Sepsis ist unsere Forschungshypothese, dass die AMPK-induzierte ACC-Phosphorylierung in Blutplättchen erhöht ist und dass dies den Blutplättchenstoffwechsel und insbesondere den Gehalt an Entzündungsmediatoren der Blutplättchen, die von AA und Lipiden stammen, modulieren könnte.

Patientenauswahl

Konsekutive Patienten mit septischem Schock, die an den Cliniques universitaires Saint-Luc, Brüssel, aufgenommen wurden, werden eingeschlossen (Experimentalgruppe)

Die Kontrollgruppe entspricht gesunden Freiwilligen mit übereinstimmendem Alter und Geschlecht, basierend auf einer retrospektiven Analyse von Patienten, die wegen Sepsis auf der Intensivstation aufgenommen wurden.

Die explorative Kontrollgruppe entspricht Patienten, die auf der Intensivstation ohne Anzeichen einer schweren Infektion und einer schweren systemischen Entzündungsreaktion aufgenommen wurden. Patienten mit neurologischen Störungen und Intoxikationen werden die Zielgruppe sein.

Ähnliche Ausschlusskriterien sind in Kontrollgruppen dieselben wie in der Versuchsgruppe.

Material und Methoden

Studientyp Prospektive, monozentrische, interventionelle Studie.

Blutentnahme Blutproben werden nach dem Einführen eines Venenkatheters innerhalb von 48 Stunden nach der Diagnose eines septischen Schocks entnommen.

Die folgenden Proben werden während des Verfahrens entnommen:

• Gerinnung einschließlich (INR, TCA, TT, PTT, Fibrinogen, DDimere) (1 grünes Röhrchen mit 3 ml)
• Multiplattenanalyse (1 orangefarbenes Röhrchen mit 3 ml)
• Blutprobe für Blutplättchen-Proteinanalyse (einschließlich ACC-Phosphorylierung). Nach der Isolierung der Blutplättchen wird das verbleibende Plasma eingefroren (2 Röhrchen CPDA mit 8,5 ml).
• Urinprobe.

Datenerfassung Die Daten werden von Medical Explorer und Q Care erfasst, einschließlich biologischer Daten, die routinemäßig bei Patienten durchgeführt werden, die auf der Intensivstation aufgenommen werden, wie Thrombozytenzahl, CRP-Spiegel, Gerinnungsbewertung, Nierenfunktion und Leberenzymologie. Es wird eine Nachsorge von mindestens 3 Jahren durchgeführt, und es sind keine zusätzlichen Besuche geplant. Ereignisse, die während des Nachsorgezeitraums aufgezeichnet wurden, werden von Medical Explorer abgerufen und bei fehlenden Daten wird ein Telefonanruf durchgeführt.

Messungen

• Zählung der Blutkörperchen einschließlich Blutplättchen.
• ACC-Phosphorylierung über Western Blotting, ECLIA.
• Thrombozytenproteinextrakt zur Proteinacetylierung.
• Thrombozytenfunktion ex vivo mittels Multiplate-Analyse.
• Plasmaprobenahme.
• Blutplättchen-Lipidomik-Analyse. ACC-Phosphorylierungsanalyse
• Plasmareiche Thrombozyten (PRP) werden nach der Zentrifugation erhalten. Apyrase und Integrilin werden hinzugefügt, um die Thrombozytenaktivierung während der Zubereitung zu begrenzen. PRP wird in 3 Proben aufgeteilt und Blutplättchen werden nach Zentrifugation bei 400 g für 10 Minuten pelletiert.
• Eine der 3 Blutplättchenproben wird mit Lemli-Lösung für die Western-Blot-Analyse von phosphoryliertem ACC, ACC1 und phosphorylierten Proteinkinase-C-Substraten lysiert. Alle Proben werden dann bei -80°C gelagert. Um verschiedene Immunoblottings zu vergleichen, werden Kontrollplättchenproben nach Thrombinstimulation entnommen. Die Blutplättchenprobe jedes Patienten wird mit derselben Kontrollprobe verglichen. Das Signal von phosphoryliertem ACC für jeden Patienten wird durch Image J quantifiziert (Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2014) und wird als Bruchteil des Kontrollprobensignals ausgedrückt.
• Der Gehalt an phosphoryliertem ACC wird durch Elektrochemilumineszenz (ECLIA, Meso Scale Discovery) und Durchflusszytometrie (FACS) bestätigt.
• Proteinextrakte werden für die Thrombozytenproteinanalyse mittels Immunoblotting verwendet.

Plasmaprobenahme

• Gerinnungsmarker einschließlich INR, TCA, TT, PTT, Fibrinogen, D-Dimere, Thrombin-Antithrombin-Komplex (TAT).
• Zytokinmessungen (TNF-alpha, IL-1b, IL-6, Chemokine- CCL 3, 5 und 18, Komplementsystem) sowie entzündliche Biomarker (hypersensibles C-reaktives Protein).
• Thrombozytenaktivierungs-Biomarker (sCD62P, sCD40L, CD62P, PF4) (Zusammenarbeit mit Dr. C. Oury, GIGA, Université de Liège, Belgien).
• Fibrinolytische Biomarker (u-PA, t-PA und PAI).
• Lipidomisch. Urin Proben von Urin werden zur gleichen Zeit wie die Blutentnahme entnommen, um die TX2B-Erzeugung zu messen.

Lipidomanalysen Lipidome werden in Zusammenarbeit mit Christine Des Rosiers im Montréal Heart Institute analysiert. Besondere Aufmerksamkeit gilt Metaboliten aus den COX- und LOX-Wegen (TXA2 und Lipoxine).

Stichprobengröße

Basierend auf unseren vorläufigen Daten haben wir festgestellt, dass die Aufnahme von mindestens 46 Patienten eine Aussagekraft von 90 % bei einem Signifikanzniveau von 5 % liefern würde, um einen Unterschied von 0,15 in der Phosphorylierung von ACC (Unterschied zwischen Kontrollgruppe 1 und Population mit septischem Schock) nachzuweisen. . In der explorativen Kontrollgruppe werden 20 Patienten erwartet.

Covid-19 - Studienänderung

Seit Dezember 2019 hat sich das neuartige schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), das die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) verursacht, von einem epidemischen Ausbruch in China zu einer Pandemie entwickelt. Schwere Infektionen sind hauptsächlich für bilaterale Lungenentzündungen verantwortlich, neue Daten deuten jedoch darauf hin, dass es sich um eine systemische Erkrankung handelt, an der mehrere Systeme einschließlich des hämatopoetischen Systems und des Immunsystems beteiligt sind. Endotheliale Aktivierung, prokoagulierender Zustand und Mikrothrombose wurden gezeigt. Allerdings ist die Pathophysiologie einer bakteriellen Sepsis nicht nachweislich ähnlich und der oben genannte Stoffwechselweg sollte auch in der Untergruppe der Covid-19-Patienten untersucht werden.

Die Covid-19-Gruppe entspricht Patienten, die auf der Intensivstation mit ARDS aufgrund einer SARS-Cov-2-Infektion und PaO2/FiO2 < 200 aufgenommen wurden. Die Aufnahme erfolgt innerhalb von 5 Tagen nach der Aufnahme und Patienten mit bakterieller Koinfektion werden ausgeschlossen. Wir planten, 46 Patienten aufzunehmen, ähnlich wie in der Kontrollgruppe und der Gruppe mit septischem Schock.