Platelets Acetyl-CoA Carboxylase Fosforylatietoestand in septische shock (PLACCSEPS)

Achtergrond

Sepsis, een systemische ontstekingsreactie die optreedt als reactie op een infectie, is een groot probleem voor de volksgezondheid en wordt erkend als de belangrijkste doodsoorzaak op de intensive care (ICU). Deze ernstige ontstekingsreactie veroorzaakt endotheliale activering en disfunctie. Dit fenomeen hangt nauw samen met de activering van de stollingscascade via blootstelling van weefselfactor (TF) aan het endotheelceloppervlak. TF dient als een anker voor stollingsfactoren VII en X waardoor ze kunnen worden geactiveerd. Dit resulteert in vorming van trombine (IIa) en productie van fibrine.

Trombine is ook een krachtige bloedplaatjesagonist (activator) die leidt tot activering en verbruik van bloedplaatjes. De stollingsbevorderende activiteit van geactiveerde bloedplaatjes tijdens sepsis bevordert de vorming van microtrombose die de orgaanperfusie verslechtert en tot de dood kan leiden. Trombocytopenie komt vaak voor en is een sterke negatieve prognostische marker bij patiënten met septische shock.

Naast coagulatie is bekend dat bloedplaatjes een sleutelrol spelen bij ontsteking en immuunrespons. Activering van bloedplaatjes kan worden geïnitieerd door ontstoken endotheel of circulatoire ontstekingscytokinen, die op hun beurt de ontstekings- en trombotische respons moduleren. Geactiveerde bloedplaatjes interageren met immuuncellen, zoals neutrofielen. Bovendien kunnen bloedplaatjes fungeren als microbiële "sensoren" door leden van de Toll-Like Receptors (TLR's) -familie tot expressie te brengen, waardoor liganden van verschillende infectieuze agentia worden gebonden. Recente gegevens benadrukken het samenspel tussen extracellulaire vallen van bloedplaatjes en neutrofielen (NET's). Bloedplaatjes vergemakkelijken de vorming van NET's en omgekeerd activeren NETS bloedplaatjes. NET's verbinden bloedplaatjes, trombose, immuunrespons en ontsteking en zijn daarom van bijzonder belang in de septische context.

Bloedplaatjes brengen Acetyl-CoA-carboxylase 1 (ACC1) tot expressie, het eerste stap-enzym van lipogenese. ACC-fosforylering op serine 79 door AMP-geactiveerde proteïnekinase (AMPK) leidt tot de remming ervan en AMPK wordt geactiveerd door trombine. We hebben aangetoond dat de AMPK-ACC-as het gehalte aan fosfolipiden van bloedplaatjes regelt, die de afgifte van TXA2 en dichte korrels beïnvloeden, en op hun beurt trombusvorming. TXA2 wordt gegenereerd uit fosfolipiden die arachidonzuur (AA) bevatten. Als alternatief kan AA worden gemetaboliseerd door de lipooxygenase (LOX) -route waarbij lipoxinen (LX) en resolvin worden geproduceerd, die eerder betrokken zijn bij het oplossen van ontstekingen. De relatie tussen AMPK-ACC-signalering en de lipooxygenaseroute is nooit onderzocht.

Onderzoeks hypothese

Wetende dat de vorming van trombine tijdens sepsis dramatisch toeneemt, is onze onderzoekshypothese dat door AMPK geïnduceerde ACC-fosforylering in bloedplaatjes wordt verhoogd en dat dit het metabolisme van bloedplaatjes en meer in het bijzonder het gehalte aan ontstekingsmediatoren van bloedplaatjes, afkomstig van AA en lipiden, zou kunnen moduleren.

Selectie van patiënten

Opeenvolgende patiënten met septische shock opgenomen in Cliniques universitaires Saint-Luc, Brussel, zullen worden opgenomen (experimentele groep)

De controlegroep zal overeenkomen met gezonde vrijwilligers met een gematchte leeftijd en geslacht, gebaseerd op retrospectieve analyse van patiënten die op de IC zijn opgenomen voor sepsis.

De verkennende controlegroep zal overeenkomen met patiënten die op de intensive care zijn opgenomen zonder tekenen van ernstige infectie en ernstige systemische ontstekingsreactie. Patiënten met een neurologische aandoening en intoxicatie zullen de doelpopulatie zijn.

Soortgelijke uitsluitingscriteria zullen hetzelfde zijn in controlegroepen als in de experimentele groep.

Materiaal en methodes

Soort onderzoek Prospectief, monocentrisch, interventioneel onderzoek.

Bloedmonsters Bloedmonsters worden afgenomen na het inbrengen van een veneuze katheter, binnen 48 uur na de diagnose septische shock.

Tijdens de procedure worden de volgende monsters genomen:

• Stolling inclusief (INR, TCA, TT, PTT, Fibrinogen, DDimers) (1 groene TUBE van 3 ml)
• Multiplate analyse (1 oranje TUBE van 3 ml)
• Bloedmonster voor eiwitanalyse van bloedplaatjes (inclusief ACC-fosforylering). Na isolatie van de bloedplaatjes wordt het resterende plasma ingevroren (2 TUBES CPDA van 8,5 ml).
• Urine monster.

Gegevensverzameling Er zullen gegevens worden verzameld van Medical Explorer en Q Care, waaronder biologische gegevens die routinematig worden uitgevoerd bij patiënten die op de IC worden opgenomen, zoals het aantal bloedplaatjes, het CRP-niveau, stollingsbeoordeling, nierfunctie en leverenzymologie. De follow-up vindt plaats over ten minste 3 jaar en er worden geen extra bezoeken gepland. Gebeurtenissen die tijdens de follow-upperiode worden geregistreerd, worden verkregen van Medical Explorer en er wordt gebeld in geval van ontbrekende gegevens.

Afmetingen

• Aantal bloedcellen inclusief bloedplaatjes.
• ACC-fosforylering via western blotting, ECLIA.
• Bloedplaatjes eiwitextract voor eiwitacetylering.
• Bloedplaatjesfunctie ex vivo met behulp van Multiplate-analyse.
• Plasma bemonstering.
• Bloedplaatjes lipidomics-analyse. ACC-fosforyleringsanalyse
• Na centrifugatie wordt plasma-rijke bloedplaatjes (PRP) verkregen. Apyrase en Integrilin worden toegevoegd om de activering van bloedplaatjes tijdens de bereiding te beperken. PRP wordt verdeeld in 3 monsters en bloedplaatjes worden gepelleteerd na centrifugatie bij 400 g gedurende 10 minuten.
• Een van de 3 bloedplaatjesmonsters zal worden gelyseerd met Lemli-oplossing voor Western-blotanalyse van gefosforyleerde ACC-, ACC1- en gefosforyleerde proteïnekinase C-substraten. Alle monsters worden dan opgeslagen bij -80°c. Om verschillende immunoblotting te vergelijken, worden na trombinestimulatie controlemonsters van bloedplaatjes verkregen. Het bloedplaatjesmonster van elke patiënt wordt vergeleken met hetzelfde controlemonster. Het signaal van gefosforyleerde ACC voor elke patiënt zal worden gekwantificeerd door Afbeelding J (Rasband, W.S., ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, VS, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2014) en wordt uitgedrukt als een fractie van het controlemonstersignaal.
• Het niveau van gefosforyleerde ACC zal worden bevestigd door elektrochemiluminescentie (ECLIA, Meso Scale Discovery) en flowcytometrie (FACS).
• Eiwitextracten zullen worden gebruikt voor eiwitanalyse van bloedplaatjes met behulp van immunoblotting.

Plasma bemonstering

• Stollingsmarkers waaronder INR, TCA, TT, PTT, fibrinogeen, D-dimeren, trombine-antitrombinecomplex (TAT).
• Cytokinemetingen (TNF-alfa, IL-1b, IL-6, chemokines-CCL 3, 5 en 18, complementsysteem) evenals inflammatoire biomarkers (overgevoelig C-reactief proteïne).
• Biomarkers voor activatie van bloedplaatjes (sCD62P, sCD40L, CD62P, PF4) (samenwerking met Dr. C. Oury, GIGA, Université de Liège, België).
• Fibrinolytische biomarkers (u-PA, t-PA en PAI).
• Lipidomisch. Urinemonsters van urine worden verzameld op dezelfde tijden als bloedmonsters om de TX2B-generatie te meten.

Lipidomische analyses Lipidome zal worden geanalyseerd in samenwerking met Christine Des Rosiers in Montréal Heart Insitute. Speciale aandacht zal worden besteed aan metabolieten van de COX- en LOX-routes (TXA2 en lipoxinen).

Steekproefgrootte

Op basis van onze voorlopige gegevens hebben we vastgesteld dat inschrijving van minimaal 46 patiënten een power van 90% zou opleveren bij een significantieniveau van 5% om een ​​verschil van 0,15 te detecteren in de fosforylering van ACC (verschil tussen controlegroep 1 en septische shockpopulatie) . In de verkennende controlegroep worden 20 patiënten verwacht.

Covid-19 - Studiewijziging

Sinds december 2019 is het nieuwe Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), dat de ziekte van Coronavirus 2019 (COVID-19) veroorzaakt, geëvolueerd van een epidemische uitbraak in China naar een pandemie. Ernstige infectie is voornamelijk verantwoordelijk voor bilaterale longontsteking, maar nieuwe gegevens wijzen erop dat het een systemische ziekte is waarbij meerdere systemen betrokken zijn, waaronder het hematopoëtische systeem en het immuunsysteem. Endotheliale activatie, procoagulantia en microtrombose zijn aangetoond. Het is echter niet aangetoond dat de pathofysiologie vergelijkbaar is met die van een bacteriële sepsis en de bovengenoemde metabolische route moet ook worden bestudeerd in de subgroep van Covid-19-patiënten.

De Covid-19-groep komt overeen met patiënten die op de IC zijn opgenomen met ARDS als gevolg van SARS-Cov-2-infectie en PaO2/FiO2 < 200. Inclusie vindt plaats binnen 5 dagen na opname en patiënten met een bacteriële co-infectie worden uitgesloten. We waren van plan om 46 patiënten in te schrijven, vergelijkbaar met de controlegroep en de septische shockgroep.