Состояние фосфорилирования ацетил-КоА-карбоксилазы тромбоцитов при септическом шоке (PLACCSEPS)

Фон

Сепсис, системная воспалительная реакция, возникающая в ответ на инфекцию, является серьезной проблемой общественного здравоохранения и признан основной причиной смерти в отделениях интенсивной терапии (ОИТ). Эта тяжелая воспалительная реакция вызывает активацию и дисфункцию эндотелия. Это явление тесно связано с активацией каскада коагуляции за счет воздействия тканевого фактора (ТФ) на поверхность эндотелиальных клеток. ТФ служит якорем для факторов свертывания VII и X, позволяя их активировать. Это приводит к образованию тромбина (IIa) и продукции фибрина.

Тромбин также является мощным агонистом тромбоцитов (активатором), что приводит к активации и потреблению тромбоцитов. Прокоагулянтная активность активированных тромбоцитов при сепсисе усиливает образование микротромбозов, которые нарушают перфузию органов и могут привести к смерти. Тромбоцитопения является распространенным явлением и является сильным негативным прогностическим маркером у пациентов с септическим шоком.

Известно, что помимо коагуляции тромбоциты играют ключевую роль в воспалении и иммунном ответе. Активация тромбоцитов может быть инициирована воспаленным эндотелием или циркулирующими воспалительными цитокинами, что, в свою очередь, модулирует воспалительный и тромботический ответ. Активированные тромбоциты взаимодействуют с иммунными клетками, такими как нейтрофилы. Кроме того, тромбоциты могут действовать как микробные «сенсоры», экспрессируя членов семейства Toll-Like Receptors (TLR), связывая лиганды нескольких инфекционных агентов. Недавние данные подчеркивают взаимодействие между тромбоцитами и нейтрофильными внеклеточными ловушками (NET). Тромбоциты способствуют образованию NET и, наоборот, NETS активируют тромбоциты. НЭО связывают тромбоциты, тромбоз, иммунный ответ и воспаление и поэтому представляют особый интерес в септическом контексте.

Тромбоциты экспрессируют ацетил-КоА-карбоксилазу 1 (ACC1), фермент первого этапа липогенеза. Фосфорилирование ACC на серине 79 с помощью AMP-активируемой протеинкиназы (AMPK) приводит к его ингибированию, а AMPK активируется тромбином. Мы продемонстрировали, что ось AMPK-ACC контролирует содержание фосфолипидов тромбоцитов, которые влияют на высвобождение TXA2 и плотных гранул и, в свою очередь, на образование тромбов. ТХА2 образуется из фосфолипидов, содержащих арахидоновую кислоту (АК). В качестве альтернативы АК может метаболизироваться липооксигеназным (LOX) путем с образованием липоксинов (LX) и резолвина, которые скорее участвуют в разрешении воспаления. Связь между передачей сигналов AMPK-ACC и липооксигеназным путем никогда не исследовалась.

Гипотеза исследования

Зная резкое увеличение образования тромбина во время сепсиса, наша исследовательская гипотеза состоит в том, что AMPK-индуцированное фосфорилирование ACC в тромбоцитах увеличивается и что это может модулировать метаболизм тромбоцитов и, в частности, содержание медиаторов воспаления в тромбоцитах, поступающих из АК и липидов.

Отбор пациентов

Будут включены последовательные пациенты с септическим шоком, поступившие в университетскую клинику Сен-Люк, Брюссель (экспериментальная группа).

Контрольная группа будет соответствовать здоровым добровольцам соответствующего возраста и пола на основании ретроспективного анализа пациентов, поступивших в ОИТ по поводу сепсиса.

Исследовательская контрольная группа будет соответствовать пациентам, поступившим в отделение интенсивной терапии без признаков тяжелой инфекции и тяжелой системной воспалительной реакции. Целевой группой будут пациенты с неврологическими расстройствами и интоксикацией.

Аналогичные критерии исключения будут такими же в контрольных группах, как и в экспериментальной группе.

Материал и методы

Тип исследования Проспективное, моноцентровое, интервенционное исследование.

Забор крови Образцы крови будут взяты после введения венозного катетера в течение 48 часов после постановки диагноза септического шока.

Во время процедуры будут взяты следующие образцы:

• Коагуляция в том числе (INR, TCA, TT, PTT, Fibrinogen, DDimers) (1 зеленая ТЮБКА 3 мл)
• Многопланшетный анализ (1 оранжевая ПРОБКА 3 мл)
• Образец крови для анализа белка тромбоцитов (включая фосфорилирование АСС). После выделения тромбоцитов оставшуюся плазму замораживают (2 ПРОБКИ CPDA по 8,5 мл).
• Образец мочи.

Сбор данных Данные будут собираться из Medical Explorer и Q Care, включая биологические данные, которые обычно собираются у пациентов, поступивших в отделение интенсивной терапии, такие как подсчет тромбоцитов, уровень СРБ, оценка коагуляции, функция почек и энзимология печени. Последующее наблюдение будет проводиться не менее чем через 3 года, и никаких дополнительных посещений не планируется. События, зарегистрированные в течение периода наблюдения, будут получены от Medical Explorer, и в случае отсутствия данных будет сделан телефонный звонок.

Измерения

• Количество клеток крови, включая тромбоциты.
• Фосфорилирование АСС методом вестерн-блоттинга, ECLIA.
• Экстракт белка тромбоцитов для ацетилирования белка.
• Функция тромбоцитов ex vivo с использованием анализа на нескольких планшетах.
• Забор плазмы.
• Липидомный анализ тромбоцитов. Анализ фосфорилирования АСС
• Плазмообогащенные тромбоциты (PRP) получают после центрифугирования. Апираза и интегрилин добавляются для ограничения активации тромбоцитов во время приготовления. PRP будет разделен на 3 образца, а тромбоциты осаждаются после центрифугирования при 400 g в течение 10 минут.
• Один из 3 образцов тромбоцитов будет лизирован раствором Лемли для вестерн-блоттинга фосфорилированных субстратов ACC, ACC1 и фосфорилированной протеинкиназы C. Затем все образцы будут храниться при температуре -80°C. Для сравнения различных иммуноблотингов контрольные образцы тромбоцитов получают после стимуляции тромбином. Образец тромбоцитов каждого пациента будет сравниваться с тем же контрольным образцом. Сигнал фосфорилированного ACC для каждого пациента будет количественно оцениваться с помощью Image J (Rasband, W.S., ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2014) и будет выражаться как доля сигнала контрольного образца.
• Уровень фосфорилированного ACC будет подтвержден с помощью электрохемилюминесценции (ECLIA, Meso Scale Discovery) и проточной цитометрии (FACS).
• Белковые экстракты будут использоваться для анализа белков тромбоцитов с помощью иммуноблоттинга.

Забор плазмы

• Маркеры коагуляции, включая INR, TCA, TT, PTT, фибриноген, D-димеры, тромбин-антитромбиновый комплекс (ТАТ).
• Измерения цитокинов (ФНО-альфа, ИЛ-1b, ИЛ-6, хемокины - CCL 3, 5 и 18, система комплемента), а также биомаркеров воспаления (гиперчувствительный С-реактивный белок).
• Биомаркеры активации тромбоцитов (sCD62P, sCD40L, CD62P, PF4) (сотрудничество с доктором C. Oury, GIGA, Льежский университет, Бельгия).
• Фибринолитические биомаркеры (u-PA, t-PA и PAI).
• Липидомический. Моча. Образцы мочи будут собираться в то же время, что и забор крови для измерения образования TX2B.

Липидомный анализ Липидом будет проанализирован в сотрудничестве с Кристин Де Розье в Монреальском институте сердца. Особое внимание будет уделено метаболитам путей ЦОГ и LOX (TXA2 и липоксины).

Размер образца

Основываясь на наших предварительных данных, мы определили, что регистрация минимум 46 пациентов обеспечит мощность 90% при уровне значимости 5% для обнаружения разницы 0,15 в фосфорилировании АСС (разница между контрольной группой 1 и популяцией с септическим шоком). . В исследовательской контрольной группе ожидается 20 пациентов.

Covid-19 - поправка к исследованию

С декабря 2019 года новый коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2), вызывающий коронавирусную болезнь 2019 года (COVID-19), превратился из эпидемической вспышки в Китае в пандемию. Тяжелая инфекция в основном вызывает двустороннюю пневмонию, но новые данные указывают на то, что это системное заболевание, затрагивающее несколько систем, включая кроветворную и иммунную системы. Показана активация эндотелия, прокоагулянтное состояние и микротромбоз. Однако не было продемонстрировано сходства патофизиологии с бактериальным сепсисом, и вышеупомянутый метаболический путь также следует изучить в подгруппе пациентов с Covid-19.

Группа Covid-19 будет соответствовать пациентам, поступившим в отделение интенсивной терапии с ОРДС из-за инфекции SARS-Cov-2 и PaO2/FiO2 < 200. Включение будет сделано в течение 5 дней после поступления, и пациенты с бактериальной коинфекцией будут исключены. Мы планировали включить 46 пациентов, как и в контрольную группу и группу с септическим шоком.