Blodplater Acetyl-CoA-karboksylase-fosforyleringstilstand i SEPtisk sjokk (PLACCSEPS)

Bakgrunn

Sepsis, en systemisk inflammatorisk reaksjon som oppstår som respons på en infeksjon, er et stort folkehelseproblem og er anerkjent som den ledende dødsårsaken på intensivavdelingen (ICU). Denne alvorlige inflammatoriske reaksjonen forårsaker endotelaktivering og dysfunksjon. Dette fenomenet er nært forbundet med aktivering av koagulasjonskaskade via eksponering av vevsfaktor (TF) ved endotelcelleoverflaten. TF fungerer som et anker for koagulasjonsfaktorer VII og X som tillater deres aktivering. Dette resulterer i generering av trombin (IIa) og fibrinproduksjon.

Trombin er også en potent blodplateagonist (aktivator) som resulterer i blodplateaktivering og -forbruk. Den pro-koagulerende aktiviteten til aktiverte blodplater under sepsis øker dannelsen av mikrotrombose som svekker organperfusjon og kan føre til død. Trombocytopeni er vanlig og er en sterk negativ prognostisk markør hos pasienter med septisk sjokk.

Utover koagulering er blodplater kjent for å spille en nøkkelrolle i betennelse og immunrespons. Blodplateaktivering kan initieres av betent endotel eller sirkulasjonsinflammatoriske cytokiner, som igjen modulerer den inflammatoriske og trombotiske responsen. Aktiverte blodplater samhandler med immunceller, som nøytrofiler. Videre kan blodplater fungere som mikrobielle "sensorer" ved å uttrykke medlemmer av Toll-Like Receptors (TLR)-familien, og binde ligander fra flere smittestoffer. Nyere data fremhever samspillet mellom blodplater og nøytrofile ekstracellulære feller (NET). Blodplater letter dannelsen av NET, og omvendt aktiverer NETS blodplater. NET forbinder blodplater, trombose, immunrespons og betennelse og er derfor av spesiell interesse i septisk sammenheng.

Blodplater uttrykker Acetyl-CoA-karboksylase 1 (ACC1), som er det første trinnet i lipogenese. ACC-fosforylering på Serine 79 av AMP-aktivert proteinkinase (AMPK) fører til hemming av det og AMPK aktiveres av trombin. Vi demonstrerte at AMPK-ACC-aksen kontrollerer innholdet av fosfolipider i blodplater, som påvirker TXA2 og frigjøring av tett granulat og i sin tur trombedannelse. TXA2 er generert fra fosfolipider som inneholder arakidonsyre (AA). Alternativt kan AA metaboliseres av lipooksygenase (LOX)-vei som produserer lipoksiner (LX) og resolvin, som er ganske involvert i oppløsningen av betennelse. Forholdet mellom AMPK-ACC-signalering og lipooksygenasevei har aldri blitt undersøkt.

Forskningshypotese

Når vi kjenner til den dramatiske økningen i trombingenerering under sepsis, er vår forskningshypotese at AMPK-indusert ACC-fosforylering i blodplater er økt og at dette kan modulere blodplatemetabolismen og mer spesielt innhold av inflammatoriske mediatorer i blodplater, som kommer fra AA og lipider.

Pasientvalg

Påfølgende pasienter med septisk sjokk innlagt ved Cliniques universitaires Saint-Luc, Brussel, vil bli inkludert (eksperimentell gruppe)

Kontrollgruppen vil tilsvare friske frivillige med matchet alder og kjønn, basert på retrospektiv analyse av pasienter innlagt på intensivavdeling for sepsis.

Eksplorativ kontrollgruppe vil tilsvare pasienter innlagt på intensivavdelingen uten tegn på alvorlig infeksjon og alvorlig systemisk inflammatorisk respons. Pasienter med nevrologisk lidelse og rus vil være målgruppen.

Lignende eksklusjonskriterier vil være de samme i kontrollgruppene som i forsøksgruppen.

Materialer og metoder

Type studie Prospektiv, monosentrisk, intervensjonell studie.

Blodprøvetaking Blodprøver vil bli tatt etter venekateterinnsetting, innen 48 timer etter septisk sjokkdiagnose.

Følgende prøver vil bli tatt under prosedyren:

• Koagulering inkludert (INR, TCA, TT, PTT, Fibrinogen, DDimerer) (1 grønt RØR på 3 ml)
• Multiplateanalyse (1 oransje RØR på 3 ml)
• Blodprøve for blodplateproteinanalyse (inkludert ACC-fosforylering). Etter blodplateisolering vil det gjenværende plasmaet fryses (2 RØR CPDA på 8,5 ml).
• Urinprøve.

Datainnsamling Data vil bli samlet inn fra Medical Explorer og Q Care, inkludert biologiske data som rutinemessig utføres hos pasienter innlagt på intensivavdelingen som antall blodplater, CRP-nivå, koagulasjonsvurdering, nyrefunksjon og leverenzymologi. Oppfølging vil bli utført i minst 3 år og det vil ikke planlegges ytterligere besøk. Hendelser registrert under oppfølgingsperioden vil bli innhentet fra Medical Explorer og en telefonsamtale vil bli tatt i tilfelle manglende data.

Målinger

• Antall blodceller inkludert blodplater.
• ACC-fosforylering via western blotting, ECLIA.
• Blodplateproteinekstrakt for proteinacetylering.
• Blodplatefunksjon ex vivo ved bruk av Multiplate-analyse.
• Plasmaprøvetaking.
• Blodplater lipidomic analyse. ACC-fosforyleringsanalyse
• Plasmarike blodplater (PRP) vil bli oppnådd etter sentrifugering. Apyrase og Integrilin tilsettes for å begrense blodplateaktivering under tilberedning. PRP vil bli delt inn i 3 prøver og blodplater vil bli pelletert etter sentrifugering ved 400 g i 10 minutter.
• En av de 3 blodplateprøvene vil bli lysert med Lemli-løsning for Western blot-analyse av fosforylerte ACC-, ACC1- og fosforylerte proteinkinase C-substrater. Alle prøver vil deretter bli lagret ved -80°c. For å sammenligne forskjellige immunblotting, blir kontrollblodplateprøver tatt etter trombinstimulering. Hver pasients blodplateprøve vil bli sammenlignet med den samme kontrollprøven. Signalet til fosforylert ACC for hver pasient vil kvantifiseres av Image J (Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2014) og vil bli uttrykt som en brøkdel av kontrollprøvesignalet.
• Nivå av fosforylert ACC vil bli bekreftet ved elektrokjemiluminescens (ECLIA, Meso Scale Discovery) og flowcytometri (FACS).
• Proteinekstrakter vil bli brukt til blodplateproteinanalyse ved bruk av immunblotting.

Plasmaprøvetaking

• Koagulasjonsmarkører inkludert INR, TCA, TT, PTT, fibrinogen, D-dimerer, trombin antitrombinkompleks (TAT).
• Cytokinmålinger (TNF-alfa, IL-1b, IL-6, kjemokiner- CCL 3, 5 og 18, komplementsystem) samt inflammatoriske biomarkører (overfølsomt C-reaktivt protein).
• Blodplateaktiveringsbiomarkører (sCD62P, sCD40L, CD62P, PF4) (samarbeid med Dr C. Oury, GIGA, Université de Liège, Belgia).
• Fibrinolytiske biomarkører (u-PA, t-PA og PAI).
• Lipidomisk. Urin Prøver av urin vil bli samlet på samme tidspunkt som blodprøvetaking for å måle TX2B-generering.

Lipidomiske analyser Lipidome vil bli analysert i samarbeid med Christine Des Rosiers i Montréal Heart Insitute. Spesiell oppmerksomhet vil bli gitt til metabolitter fra COX- og LOX-veiene (TXA2 og lipoksiner).

Prøvestørrelse

Basert på våre foreløpige data, bestemte vi at registrering av minimum 46 pasienter ville gi en kraft på 90 % ved et signifikansnivå på 5 % for å oppdage en forskjell på 0,15 i fosforyleringen av ACC (forskjell mellom kontrollgruppe 1 og septisk sjokkpopulasjon) . Det forventes 20 pasienter i den eksplorative kontrollgruppen.

Covid-19 - Studieendring

Siden desember 2019 har det nye alvorlige akutte respiratoriske syndromet Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) som forårsaker koronavirussykdom 2019 (COVID-19) utviklet seg fra et epidemiutbrudd i Kina til en pandemi. Alvorlig infeksjon er hovedsakelig ansvarlig for bilateral lungebetennelse, men nye data indikerer at det er en systemisk sykdom som involverer flere systemer, inkludert det hematopoetiske systemet og immunsystemet. Endotelaktivering, prokoagulant tilstand og mikrotrombose er vist. Imidlertid er patofysiologien ikke vist å være lik en bakteriell sepsis, og den ovennevnte metabolske veien bør også studeres i undergruppen av Covid-19-pasienter.

Covid-19-gruppen vil tilsvare pasienter innlagt på intensivavdelingen med ARDS på grunn av SARS-Cov-2-infeksjon og PaO2/FiO2 < 200. Inkludering vil skje innen 5 dager etter innleggelse og pasienter med bakteriell samtidig infeksjon vil bli ekskludert. Vi planla å registrere 46 pasienter, på samme måte som kontrollgruppen og septisk sjokkgruppen.