Stan fosforylacji karboksylazy acetylo-CoA płytek we wstrząsie septycznym (PLACCSEPS)

Tło

Sepsa, ogólnoustrojowa reakcja zapalna występująca w odpowiedzi na infekcję, jest poważnym problemem zdrowia publicznego i jest uznawana za główną przyczynę zgonów na oddziałach intensywnej terapii (OIOM). Ta ciężka reakcja zapalna powoduje aktywację i dysfunkcję śródbłonka. Zjawisko to jest ściśle związane z aktywacją kaskady krzepnięcia poprzez ekspozycję czynnika tkankowego (TF) na powierzchni komórek śródbłonka. TF służy jako kotwica dla czynników krzepnięcia VII i X umożliwiając ich aktywację. Powoduje to wytwarzanie trombiny (IIa) i wytwarzanie fibryny.

Trombina jest również silnym agonistą (aktywatorem) płytek krwi, co powoduje aktywację i zużycie płytek krwi. Aktywność prokoagulacyjna aktywowanych płytek krwi podczas sepsy nasila powstawanie mikrozakrzepów, które upośledzają perfuzję narządów i mogą prowadzić do śmierci. Małopłytkowość jest powszechna i jest silnym negatywnym wskaźnikiem prognostycznym u pacjentów ze wstrząsem septycznym.

Oprócz krzepnięcia, wiadomo, że płytki krwi odgrywają kluczową rolę w stanach zapalnych i odpowiedzi immunologicznej. Aktywacja płytek krwi może być inicjowana przez zapalenie śródbłonka lub krążące cytokiny zapalne, które z kolei modulują odpowiedź zapalną i zakrzepową. Aktywowane płytki krwi wchodzą w interakcje z komórkami odpornościowymi, takimi jak neutrofile. Ponadto płytki krwi mogą działać jako „czujniki” drobnoustrojów poprzez ekspresję członków rodziny receptorów Toll-Like (TLR), wiążących ligandy z kilku czynników zakaźnych. Najnowsze dane podkreślają wzajemne oddziaływanie między płytkami krwi a zewnątrzkomórkowymi pułapkami neutrofili (NET). Płytki krwi ułatwiają tworzenie NET i odwrotnie, NETS aktywują płytki krwi. NET łączą płytki krwi, zakrzepicę, odpowiedź immunologiczną i zapalenie, dlatego są szczególnie interesujące w kontekście septycznym.

Płytki krwi wykazują ekspresję karboksylazy acetylo-CoA 1 (ACC1), która jest enzymem pierwszego etapu lipogenezy. ACC Fosforylacja seryny 79 przez kinazę białkową aktywowaną przez AMP (AMPK) prowadzi do jej zahamowania, a AMPK jest aktywowany przez trombinę. Wykazaliśmy, że oś AMPK-ACC kontroluje zawartość fosfolipidów płytek krwi, które wpływają na uwalnianie TXA2 i gęstych granulek, a co za tym idzie na tworzenie skrzepliny. TXA2 jest generowany z fosfolipidów zawierających kwas arachidonowy (AA). Alternatywnie, AA może być metabolizowany przez szlak lipooksygenazy (LOX) wytwarzający lipoksyny (LX) i rezolwinę, które są raczej zaangażowane w ustępowanie stanu zapalnego. Związek między sygnalizacją AMPK-ACC a szlakiem lipooksygenazy nigdy nie był badany.

Hipoteza badawcza

Znając dramatyczny wzrost wytwarzania trombiny podczas sepsy, nasza hipoteza badawcza jest taka, że ​​indukowana przez AMPK fosforylacja ACC w płytkach krwi jest zwiększona i że może to modulować metabolizm płytek krwi, aw szczególności zawartość mediatorów zapalnych w płytkach krwi, pochodzących z AA i lipidów.

Selekcja pacjentów

Uwzględnieni zostaną kolejni pacjenci ze wstrząsem septycznym przyjmowani w Cliniques universitaires Saint-Luc w Brukseli (grupa eksperymentalna)

Grupę kontrolną stanowić będą zdrowi ochotnicy dobrani pod względem wieku i płci, na podstawie retrospektywnej analizy pacjentów przyjętych na OIT z powodu sepsy.

Eksploracyjna grupa kontrolna będzie odpowiadać pacjentom przyjętym na oddział intensywnej terapii bez objawów ciężkiej infekcji i ciężkiej ogólnoustrojowej odpowiedzi zapalnej. Populacją docelową będą pacjenci z zaburzeniami neurologicznymi i zatruciami.

Podobne kryteria wykluczenia będą takie same w grupach kontrolnych, jak w grupie eksperymentalnej.

Materiał i metody

Rodzaj badania Badanie prospektywne, monocentryczne, interwencyjne.

Pobieranie krwi Próbki krwi będą pobierane po wprowadzeniu cewnika żylnego, w ciągu 48 godzin od rozpoznania wstrząsu septycznego.

W trakcie procedury zostaną pobrane następujące próbki:

• Koagulacja w tym (INR, TCA, TT, PTT, fibrynogen, DDimery) (1 zielona TUBE 3 ml)
• Analiza wielopłytkowa (1 pomarańczowa TUBE 3 ml)
• Próbka krwi do analizy białek płytek krwi (w tym fosforylacji ACC). Po izolacji płytek pozostałe osocze zostanie zamrożone (2 PROBÓWKI CPDA po 8,5 ml).
• Próbka moczu.

Gromadzenie danych Dane zostaną zebrane z Medical Explorer i Q Care, w tym dane biologiczne, które są rutynowo wykonywane u pacjentów przyjmowanych na OIOM, takie jak liczba płytek krwi, poziom CRP, ocena krzepnięcia, czynność nerek i enzymologia wątroby. Kontrola zostanie przeprowadzona przez co najmniej 3 lata i nie będą planowane żadne dodatkowe wizyty. Zdarzenia zarejestrowane w okresie obserwacji zostaną uzyskane z Medical Explorer, aw przypadku braku danych zostanie wykonana rozmowa telefoniczna.

Pomiary

• Liczba krwinek, w tym płytek krwi.
• Fosforylacja ACC metodą Western blotting, ECLIA.
• Ekstrakt białkowy z płytek krwi do acetylacji białek.
• Funkcja płytek krwi ex vivo przy użyciu analizy wielopłytkowej.
• Pobieranie próbek osocza.
• Analiza lipidomiczna płytek krwi. Analiza fosforylacji ACC
• Płytki bogatopłytkowe (PRP) zostaną uzyskane po odwirowaniu. Apyraza i Integrilina są dodawane w celu ograniczenia aktywacji płytek krwi podczas przygotowania. PRP zostanie podzielony na 3 próbki, a płytki zostaną poddane osadzeniu po odwirowaniu przy 400 g przez 10 minut.
• Jedna z 3 próbek płytek krwi zostanie poddana lizie roztworem Lemli do analizy Western blot fosforylowanych substratów ACC, ACC1 i fosforylowanej kinazy białkowej C. Wszystkie próbki będą przechowywane w temperaturze -80°C. W celu porównania różnych immunoblottingów, po stymulacji trombiną uzyskuje się kontrolne próbki płytek krwi. Próbka płytek krwi każdego pacjenta zostanie porównana z tą samą próbką kontrolną. Sygnał fosforylowanego ACC dla każdego pacjenta zostanie określony ilościowo za pomocą Image J (Rasband, WS, ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2014) i zostanie wyrażony jako ułamek sygnału próbki kontrolnej.
• Poziom fosforylowanego ACC zostanie potwierdzony za pomocą elektrochemiluminescencji (ECLIA, Meso Scale Discovery) oraz cytometrii przepływowej (FACS).
• Ekstrakty białkowe zostaną wykorzystane do analizy białek płytek krwi metodą immunoblottingu.

Pobieranie próbek osocza

• Markery krzepnięcia, w tym INR, TCA, TT, PTT, fibrynogen, D-dimery, kompleks trombina-antytrombina (TAT).
• Pomiary cytokin (TNF-alfa, IL-1b, IL-6, chemokin- CCL 3, 5 i 18, układ dopełniacza) oraz biomarkerów stanu zapalnego (nadwrażliwe białko C-reaktywne).
• Biomarkery aktywacji płytek krwi (sCD62P, sCD40L, CD62P, PF4) (współpraca z dr C. Oury, GIGA, Université de Liège, Belgia).
• Biomarkery fibrynolityczne (u-PA, t-PA i PAI).
• lipidomiczny. Mocz Próbki moczu będą pobierane w tym samym czasie co pobieranie krwi w celu pomiaru generacji TX2B.

Analizy lipidomiczne Lipidom będzie analizowany we współpracy z Christine Des Rosiers w Montréal Heart Insitute. Szczególna uwaga zostanie zwrócona na metabolity szlaków COX i LOX (TXA2 i lipoksyny).

Wielkość próbki

Na podstawie naszych wstępnych danych ustaliliśmy, że włączenie minimum 46 pacjentów zapewni moc 90% na poziomie istotności 5% do wykrycia różnicy 0,15 w fosforylacji ACC (różnica między grupą kontrolną 1 a populacją wstrząsu septycznego) . Oczekuje się 20 pacjentów w eksploracyjnej grupie kontrolnej.

Covid-19 - Zmiana studium

Od grudnia 2019 r. nowy koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) wywołujący chorobę koronawirusową 2019 (COVID-19) przekształcił się z wybuchu epidemii w Chinach w pandemię. Ciężka infekcja jest głównie odpowiedzialna za obustronne zapalenie płuc, ale pojawiające się dane wskazują, że jest to choroba ogólnoustrojowa obejmująca wiele układów, w tym układ krwiotwórczy i układ odpornościowy. Wykazano aktywację śródbłonka, stan prokoagulacyjny i mikrozakrzepicę. Jednak nie wykazano, aby patofizjologia była podobna do posocznicy bakteryjnej, a wyżej wymieniony szlak metaboliczny należy również zbadać w podgrupie pacjentów z Covid-19.

Grupa Covid-19 będzie odpowiadała pacjentom przyjętym na OIT z ARDS z powodu zakażenia SARS-Cov-2 i PaO2/FiO2 < 200. Włączenie zostanie przeprowadzone w ciągu 5 dni po przyjęciu, a pacjenci ze współistniejącym zakażeniem bakteryjnym zostaną wykluczeni. Planowaliśmy włączyć 46 pacjentów, podobnie jak w grupie kontrolnej i we wstrząsie septycznym.