État de phosphorylation de l'acétyl-CoA carboxylase des plaquettes dans le choc SEPtique (PLACCSEPS)

Arrière plan

Le sepsis, réaction inflammatoire systémique survenant en réponse à une infection, est un problème majeur de santé publique et est reconnu comme la première cause de décès en unité de soins intensifs (USI). Cette réaction inflammatoire sévère provoque une activation et un dysfonctionnement endothélial. Ce phénomène est étroitement associé à l'activation de la cascade de coagulation via l'exposition du facteur tissulaire (TF) à la surface des cellules endothéliales. Le TF sert de point d'ancrage aux facteurs de coagulation VII et X permettant leur activation. Cela entraîne la génération de thrombine (IIa) et la production de fibrine.

La thrombine est également un puissant agoniste plaquettaire (activateur) entraînant l'activation et la consommation des plaquettes. L'activité pro-coagulante des plaquettes activées au cours de la septicémie favorise la formation de micro-thrombose qui altère la perfusion des organes et peut entraîner la mort. La thrombocytopénie est fréquente et constitue un marqueur pronostique négatif fort chez les patients en choc septique.

Au-delà de la coagulation, les plaquettes sont connues pour jouer un rôle clé dans l'inflammation et la réponse immunitaire. L'activation des plaquettes peut être initiée par l'endothélium enflammé ou les cytokines inflammatoires circulatoires, qui à leur tour modulent la réponse inflammatoire et thrombotique. Les plaquettes activées interagissent avec les cellules immunitaires, comme les neutrophiles. De plus, les plaquettes peuvent agir comme des "capteurs" microbiens en exprimant des membres de la famille des récepteurs Toll-Like (TLR), liant les ligands de plusieurs agents infectieux. Des données récentes mettent en évidence l'interaction entre les plaquettes et les pièges extracellulaires des neutrophiles (NET). Les plaquettes facilitent la formation des NET et, inversement, les NETS activent les plaquettes. Les TNE relient les plaquettes, la thrombose, la réponse immunitaire et l'inflammation et présentent donc un intérêt particulier dans le contexte septique.

Les plaquettes expriment l'acétyl-CoA carboxylase 1 (ACC1), qui est la première enzyme de la lipogenèse. La phosphorylation de l'ACC sur la sérine 79 par la protéine kinase activée par l'AMP (AMPK) conduit à son inhibition et l'AMPK est activée par la thrombine. Nous avons démontré que l'axe AMPK-ACC contrôle la teneur en phospholipides des plaquettes, qui influencent la libération de TXA2 et de granules denses et, à leur tour, la formation de thrombus. Le TXA2 est généré à partir de phospholipides contenant de l'acide arachidonique (AA). Alternativement, l'AA peut être métabolisé par la voie de la lipooxygénase (LOX) produisant des lipoxines (LX) et de la résolvine, qui sont plutôt impliquées dans la résolution de l'inflammation. La relation entre la signalisation AMPK-ACC et la voie de la lipooxygénase n'a jamais été étudiée.

Hypothèse de recherche

Connaissant l'augmentation spectaculaire de la génération de thrombine au cours du sepsis, notre hypothèse de recherche est que la phosphorylation de l'ACC induite par l'AMPK dans les plaquettes est augmentée et que cela pourrait moduler le métabolisme des plaquettes et plus particulièrement le contenu des médiateurs inflammatoires des plaquettes, provenant des AA et des lipides.

Sélection des patients

Les patients consécutifs en choc septique admis aux Cliniques universitaires Saint-Luc, Bruxelles, seront inclus (groupe expérimental)

Le groupe témoin correspondra à des volontaires sains d'âge et de sexe appariés, sur la base d'une analyse rétrospective des patients admis en soins intensifs pour sepsis.

Le groupe témoin exploratoire correspondra aux patients admis en unité de soins intensifs sans signes d'infection sévère et de réponse inflammatoire systémique sévère. Les patients souffrant de troubles neurologiques et d'intoxication seront la population cible.

Des critères d'exclusion similaires seront les mêmes dans les groupes témoins que dans le groupe expérimental.

matériel et méthodes

Type d'étude Étude prospective, monocentrique, interventionnelle.

Prélèvement sanguin Des échantillons de sang seront prélevés après l'insertion du cathéter veineux, dans les 48 heures suivant le diagnostic de choc septique.

Les échantillons suivants seront prélevés au cours de la procédure :

• Coagulation dont (INR, TCA, TT, PTT, Fibrinogène, DDimères) (1 TUBE vert de 3 ml)
• Analyse multiplaques (1 TUBE orange de 3 ml)
• Échantillon de sang pour l'analyse des protéines plaquettaires (y compris la phosphorylation de l'ACC). Après isolement des plaquettes, le plasma restant sera congelé (2 TUBES CPDA de 8,5 ml).
• Échantillon d'urine.

Collecte des données Les données seront collectées à partir de Medical Explorer et Q Care, y compris les données biologiques qui sont régulièrement effectuées chez les patients admis aux soins intensifs comme la numération plaquettaire, le niveau de CRP, l'évaluation de la coagulation, la fonction rénale et l'enzymologie hépatique. Un suivi sera effectué d'au moins 3 ans et aucune visite supplémentaire ne sera prévue. Les événements enregistrés pendant la période de suivi seront obtenus auprès de Medical Explorer et un appel téléphonique sera effectué en cas de données manquantes.

Des mesures

• Numération des cellules sanguines, y compris les plaquettes.
• Phosphorylation de l'ACC via western blot, ECLIA.
• Extrait de protéines plaquettaires pour l'acétylation des protéines.
• Fonction plaquettaire ex vivo en utilisant l'analyse Multiplate.
• Prélèvement de plasma.
• Analyse lipidomique des plaquettes. Analyse de phosphorylation de l'ACC
• Le plasma riche en plaquettes (PRP) sera obtenu après centrifugation. L'Apyrase et l'Integrilin sont ajoutés pour limiter l'activation plaquettaire lors de la préparation. Le PRP sera divisé en 3 échantillons et les plaquettes seront culottées après centrifugation à 400 g pendant 10 minutes.
• L'un des 3 échantillons de plaquettes sera lysé avec une solution de Lemli pour l'analyse Western blot des substrats phosphorylés ACC, ACC1 et protéine kinase C phosphorylée. Tous les échantillons seront ensuite stockés à -80°c. Afin de comparer différents immunotransferts, des échantillons de plaquettes témoins sont obtenus après stimulation par la thrombine. L'échantillon de plaquettes de chaque patient sera comparé au même échantillon de contrôle. Le signal de l'ACC phosphorylé pour chaque patient sera quantifié par Image J (Rasband, W.S., ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2014) et sera exprimé comme une fraction du signal de l'échantillon de contrôle.
• Le niveau d'ACC phosphorylé sera confirmé par électrochimiluminescence (ECLIA, Meso Scale Discovery) et cytométrie en flux (FACS).
• Les extraits protéiques seront utilisés pour l'analyse des protéines plaquettaires par immunotransfert.

Échantillonnage de plasma

• Marqueurs de coagulation dont INR, TCA, TT, PTT, fibrinogène, D-dimères, complexe thrombine antithrombine (TAT).
• Mesures des cytokines (TNF-alpha, IL-1b, IL-6, chimiokines-CCL 3, 5 et 18, système du complément) ainsi que des biomarqueurs inflammatoires (protéine C-réactive hypersensible).
• Biomarqueurs d'activation plaquettaire (sCD62P, sCD40L, CD62P, PF4) (collaboration avec le Dr C. Oury, GIGA, Université de Liège, Belgique).
• Biomarqueurs fibrinolytiques (u-PA, t-PA et PAI).
• Lipidomique. Urines Des échantillons d'urines seront prélevés en même temps que les prélèvements sanguins pour mesurer la génération de TX2B.

Analyses lipidiques Lipidome sera analysé en collaboration avec Christine Des Rosiers à l'Institut de Cardiologie de Montréal. Une attention particulière sera portée aux métabolites des voies COX et LOX (TXA2 et lipoxines).

Taille de l'échantillon

Sur la base de nos données préliminaires, nous avons déterminé que le recrutement d'au moins 46 patients fournirait une puissance de 90 % à un niveau de signification de 5 % pour détecter une différence de 0,15 dans la phosphorylation de l'ACC (différence entre le groupe témoin 1 et la population en choc septique) . 20 patients sont attendus dans le groupe contrôle exploratoire.

Covid-19 - Modification de l'étude

Depuis décembre 2019, le nouveau coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) à l'origine de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) est passé d'une épidémie en Chine à une pandémie. L'infection sévère est principalement responsable de la pneumonie bilatérale, mais de nouvelles données indiquent qu'il s'agit d'une maladie systémique impliquant plusieurs systèmes, y compris le système hématopoïétique et immunitaire. L'activation endothéliale, l'état procoagulant et la micro-thrombose ont été mis en évidence. Cependant, la physiopathologie n'a pas été démontrée comme étant similaire à un sepsis bactérien et la voie métabolique susmentionnée devrait également être étudiée dans le sous-groupe de patients Covid-19.

Le groupe Covid-19 correspondra aux patients admis en réanimation avec SDRA dû à une infection par le SARS-Cov-2 et PaO2/FiO2 < 200. L'inclusion se fera dans les 5 jours suivant l'admission et les patients présentant une co-infection bactérienne seront exclus. Nous avions prévu d'inscrire 46 patients, comme dans le groupe contrôle et choc septique.