Platelets Acetyl-CoA Carboxylase Phosphorylation State in SEPtic Shock (PLACCSEPS)

Sfondo

La sepsi, una reazione infiammatoria sistemica che si verifica in risposta a un'infezione, è un grave problema di salute pubblica ed è riconosciuta come la principale causa di morte nelle unità di terapia intensiva (ICU). Questa grave reazione infiammatoria provoca attivazione e disfunzione endoteliale. Questo fenomeno è strettamente associato all'attivazione della cascata della coagulazione attraverso l'esposizione del fattore tissutale (TF) sulla superficie delle cellule endoteliali. Il TF funge da ancoraggio per i fattori della coagulazione VII e X permettendone l'attivazione. Ciò si traduce nella generazione di trombina (IIa) e nella produzione di fibrina.

La trombina è anche un potente agonista piastrinico (attivatore) con conseguente attivazione e consumo piastrinico. L'attività pro-coagulante delle piastrine attivate durante la sepsi aumenta la formazione di microtrombosi che compromettono la perfusione degli organi e possono portare alla morte. La trombocitopenia è comune ed è un forte marcatore prognostico negativo nei pazienti con shock settico.

Oltre alla coagulazione, è noto che le piastrine svolgono un ruolo chiave nell'infiammazione e nella risposta immunitaria. L'attivazione delle piastrine può essere avviata dall'endotelio infiammato o dalle citochine infiammatorie circolatorie, che a loro volta modulano la risposta infiammatoria e trombotica. Le piastrine attivate interagiscono con le cellule immunitarie, come i neutrofili. Inoltre, le piastrine possono agire come "sensori" microbici esprimendo membri della famiglia Toll-Like Receptors (TLR), legando ligandi di diversi agenti infettivi. Dati recenti evidenziano l'interazione tra piastrine e trappole extracellulari dei neutrofili (NET). Le piastrine facilitano la formazione dei NET e, inversamente, i NET attivano le piastrine. I NET collegano piastrine, trombosi, risposta immunitaria e infiammazione e pertanto sono di particolare interesse nel contesto settico.

Le piastrine esprimono l'acetil-CoA carbossilasi 1 (ACC1), che è il primo enzima della lipogenesi. La fosforilazione dell'ACC sulla serina 79 da parte della protein chinasi attivata da AMP (AMPK) porta alla sua inibizione e l'AMPK viene attivato dalla trombina. Abbiamo dimostrato che l'asse AMPK-ACC controlla il contenuto di fosfolipidi delle piastrine, che influenzano il rilascio di TXA2 e granuli densi e, a sua volta, la formazione di trombi. TXA2 è generato da fosfolipidi contenenti acido arachidonico (AA). In alternativa, l'AA può essere metabolizzato dalla via della lipossigenasi (LOX) producendo lipossine (LX) e resolvina, che sono piuttosto coinvolte nella risoluzione dell'infiammazione. La relazione tra la segnalazione AMPK-ACC e la via della lipoossigenasi non è mai stata studiata.

Ipotesi di ricerca

Conoscendo il drammatico aumento della generazione di trombina durante la sepsi, la nostra ipotesi di ricerca è che la fosforilazione dell'ACC indotta da AMPK nelle piastrine sia aumentata e che ciò possa modulare il metabolismo delle piastrine e più in particolare il contenuto dei mediatori dell'infiammazione delle piastrine, provenienti da AA e lipidi.

Selezione dei pazienti

Saranno inclusi pazienti consecutivi con shock settico ricoverati presso Cliniques universitaires Saint-Luc, Bruxelles (gruppo sperimentale)

Il gruppo di controllo corrisponderà a volontari sani con età e sesso abbinati, sulla base dell'analisi retrospettiva dei pazienti ricoverati in terapia intensiva per sepsi.

Il gruppo di controllo esplorativo corrisponderà a pazienti ricoverati nell'unità di terapia intensiva senza evidenza di grave infezione e grave risposta infiammatoria sistemica. I pazienti con disturbi neurologici e intossicazione saranno la popolazione target.

Criteri di esclusione simili saranno gli stessi nei gruppi di controllo rispetto al gruppo sperimentale.

materiale e metodi

Tipo di studio Studio prospettico, monocentrico, interventistico.

Prelievo di sangue I campioni di sangue saranno raccolti dopo l'inserimento del catetere venoso, entro 48 ore dalla diagnosi di shock settico.

Durante la procedura verranno prelevati i seguenti campioni:

• Coagulazione inclusi (INR, TCA, TT, PTT, Fibrinogeno, DDimeri) (1 TUBO verde da 3 ml)
• Analisi multipiastra (1 TUBE arancione da 3 ml)
• Campione di sangue per l'analisi delle proteine ​​piastriniche (compresa la fosforilazione dell'ACC). Dopo l'isolamento delle piastrine, il plasma rimanente sarà congelato (2 TUBE CPDA da 8.5 ml).
• Campione di urina.

Raccolta dei dati I dati saranno raccolti da Medical Explorer e Q Care, compresi i dati biologici che vengono regolarmente eseguiti nei pazienti ricoverati in terapia intensiva come conta piastrinica, livello di CRP, valutazione della coagulazione, funzionalità renale ed enzimologia epatica. Il follow-up sarà eseguito per almeno 3 anni e non saranno programmate visite aggiuntive. Gli eventi registrati durante il periodo di follow-up saranno ottenuti da Medical Explorer e verrà effettuata una telefonata in caso di dati mancanti.

Misure

• Conta delle cellule del sangue comprese le piastrine.
• Fosforilazione dell'ACC tramite western blotting, ECLIA.
• Estratto proteico delle piastrine per l'acetilazione delle proteine.
• Funzione piastrinica ex vivo mediante analisi Multiplate.
• Campionamento plasmatico.
• Analisi lipidomica delle piastrine. Analisi della fosforilazione dell'ACC
• Le piastrine ricche di plasma (PRP) saranno ottenute dopo centrifugazione. Apyrase e Integrilin vengono aggiunti per limitare l'attivazione piastrinica durante la preparazione. Il PRP sarà suddiviso in 3 campioni e le piastrine saranno pellettate dopo centrifugazione a 400 g per 10 minuti.
• Uno dei 3 campioni di piastrine sarà lisato con soluzione di Lemli per l'analisi Western blot di ACC fosforilato, ACC1 e substrati di proteina chinasi C fosforilata. Tutti i campioni verranno quindi stoccati a -80°C. Al fine di confrontare diversi immunoblotting, i campioni di piastrine di controllo vengono ottenuti dopo la stimolazione della trombina. Il campione di piastrine di ciascun paziente verrà confrontato con lo stesso campione di controllo. Il segnale di ACC fosforilato per ogni paziente sarà quantificato da Image J (Rasband, W.S., ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2014) e sarà espresso come frazione del segnale del campione di controllo.
• Il livello di ACC fosforilato sarà confermato mediante elettrochemiluminescenza (ECLIA, Meso Scale Discovery) e citometria a flusso (FACS).
• Gli estratti proteici saranno utilizzati per l'analisi delle proteine ​​piastriniche mediante immunoblotting.

Campionamento plasmatico

• Marcatori della coagulazione inclusi INR, TCA, TT, PTT, fibrinogeno, D-dimeri, complesso trombina-antitrombina (TAT).
• Misurazioni di citochine (TNF-alfa, IL-1b, IL-6, chemochine-CCL 3, 5 e 18, sistema del complemento) e biomarcatori infiammatori (proteina C-reattiva ipersensibile).
• Biomarcatori di attivazione piastrinica (sCD62P, sCD40L, CD62P, PF4) (collaborazione con Dr C. Oury, GIGA, Université de Liège, Belgio).
• Biomarcatori fibrinolitici (u-PA, t-PA e PAI).
• Lipidomico. Urine I campioni di urina saranno raccolti negli stessi tempi del prelievo di sangue per misurare la generazione di TX2B.

Analisi lipidomiche Lipidome sarà analizzato in collaborazione con Christine Des Rosiers al Montréal Heart Insitute. Particolare attenzione sarà data ai metaboliti delle vie COX e LOX (TXA2 e lipoxine).

Misura di prova

Sulla base dei nostri dati preliminari, abbiamo determinato che l'arruolamento di un minimo di 46 pazienti fornirebbe una potenza del 90% a un livello di significatività del 5% per rilevare una differenza di 0,15 nella fosforilazione dell'ACC (differenza tra gruppo di controllo 1 e popolazione con shock settico) . 20 pazienti sono attesi nel gruppo di controllo esplorativo.

Covid-19 - Studio emendamento

Da dicembre 2019, la nuova sindrome respiratoria acuta grave da coronavirus 2 (SARS-CoV-2) che causa la malattia da coronavirus 2019 (COVID-19) si è evoluta da focolaio epidemico in Cina a pandemia. L'infezione grave è principalmente responsabile della polmonite bilaterale, ma i dati emergenti indicano che si tratta di una malattia sistemica che coinvolge più sistemi tra cui il sistema ematopoietico e immunitario. È stata dimostrata l'attivazione endoteliale, lo stato procoagulante e la microtrombosi. Tuttavia, la fisiopatologia non è stata dimostrata essere simile a una sepsi batterica e la suddetta via metabolica dovrebbe essere studiata anche nel sottogruppo di pazienti Covid-19.

Il gruppo Covid-19 corrisponderà ai pazienti ricoverati in terapia intensiva con ARDS a causa di infezione da SARS-Cov-2 e PaO2/FiO2 < 200. L'inclusione verrà effettuata entro 5 giorni dal ricovero e i pazienti con coinfezione batterica verranno esclusi. Abbiamo pianificato di arruolare 46 pazienti, analogamente al gruppo di controllo e shock settico.