Estado de fosforilación de acetil-CoA carboxilasa de plaquetas en shock séptico (PLACCSEPS)

Fondo

La sepsis, una reacción inflamatoria sistémica que ocurre en respuesta a una infección, es un importante problema de salud pública y se reconoce como la principal causa de muerte en la unidad de cuidados intensivos (UCI). Esta severa reacción inflamatoria provoca activación y disfunción endotelial. Este fenómeno está estrechamente relacionado con la activación de la cascada de la coagulación a través de la exposición del factor tisular (TF) en la superficie de las células endoteliales. El TF sirve como ancla para los factores de coagulación VII y X permitiendo su activación. Esto da como resultado la generación de trombina (IIa) y la producción de fibrina.

La trombina también es un potente agonista plaquetario (activador) que provoca la activación y el consumo de plaquetas. La actividad procoagulante de las plaquetas activadas durante la sepsis aumenta la formación de microtrombosis que alteran la perfusión de los órganos y pueden causar la muerte. La trombocitopenia es común y es un fuerte marcador de pronóstico negativo en pacientes con shock séptico.

Más allá de la coagulación, se sabe que las plaquetas desempeñan un papel clave en la inflamación y la respuesta inmunitaria. La activación plaquetaria puede ser iniciada por el endotelio inflamado o por citocinas inflamatorias circulatorias, que a su vez modulan la respuesta inflamatoria y trombótica. Las plaquetas activadas interactúan con las células inmunitarias, como los neutrófilos. Además, las plaquetas pueden actuar como "sensores" microbianos al expresar miembros de la familia de receptores tipo Toll (TLR), uniendo ligandos de varios agentes infecciosos. Los datos recientes destacan la interacción entre las trampas extracelulares (NET) de plaquetas y neutrófilos. Las plaquetas facilitan la formación de NET y, a la inversa, las NET activan las plaquetas. Los NET conectan plaquetas, trombosis, respuesta inmune e inflamación y, por lo tanto, son de particular interés en el contexto séptico.

Las plaquetas expresan Acetil-CoA carboxilasa 1 (ACC1), que es la enzima del primer paso de la lipogénesis. La fosforilación de ACC en Serine 79 por la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) conduce a su inhibición y la AMPK es activada por la trombina. Demostramos que el eje AMPK-ACC controla el contenido de fosfolípidos de las plaquetas, que influyen en la liberación de TXA2 y gránulos densos y, a su vez, en la formación de trombos. TXA2 se genera a partir de fosfolípidos que contienen ácido araquidónico (AA). Alternativamente, el AA puede ser metabolizado por la vía de la lipooxigenasa (LOX) produciendo lipoxinas (LX) y resolvina, que están bastante involucradas en la resolución de la inflamación. La relación entre la señalización de AMPK-ACC y la vía de la lipooxigenasa nunca se ha investigado.

Hipótesis de la investigación

Conociendo el aumento dramático en la generación de trombina durante la sepsis, nuestra hipótesis de investigación es que la fosforilación de ACC inducida por AMPK en las plaquetas aumenta y que esto podría modular el metabolismo de las plaquetas y más particularmente el contenido de mediadores inflamatorios de las plaquetas, provenientes de AA y lípidos.

Selección de pacientes

Se incluirán pacientes consecutivos con shock séptico ingresados ​​en Cliniques universitaires Saint-Luc, Bruselas (grupo experimental)

El grupo de control corresponderá a voluntarios sanos de edad y género coincidentes, en base al análisis retrospectivo de pacientes ingresados ​​en UCI por sepsis.

El grupo control exploratorio corresponderá a los pacientes ingresados ​​en la unidad de cuidados intensivos sin evidencia de infección severa y respuesta inflamatoria sistémica severa. Los pacientes con trastorno neurológico e intoxicación serán la población diana.

Los criterios de exclusión similares serán los mismos en los grupos de control que en el grupo experimental.

material y métodos

Tipo de estudio Estudio prospectivo, monocéntrico, de intervención.

Toma de muestra de sangre Las muestras de sangre se recolectarán después de la inserción del catéter venoso, dentro de las 48 horas posteriores al diagnóstico de shock séptico.

Durante el procedimiento se tomarán las siguientes muestras:

• Coagulación incluyendo (INR, TCA, TT, PTT, Fibrinógeno, DDimers) (1 TUBO verde de 3 ml)
• Análisis multiplaca (1 TUBO naranja de 3 ml)
• Muestra de sangre para análisis de proteínas plaquetarias (incluida la fosforilación de ACC). Tras el aislamiento de las plaquetas, el plasma restante se congelará (2 TUBOS CPDA de 8,5 ml).
• Muestra de orina.

Recopilación de datos Los datos se recopilarán de Medical Explorer y Q Care, incluidos los datos biológicos que se realizan de forma rutinaria en pacientes ingresados ​​en la UCI, como recuento de plaquetas, nivel de CRP, evaluación de la coagulación, función renal y enzimología hepática. Se realizará un seguimiento de al menos 3 años y no se planificarán visitas adicionales. Los eventos registrados durante el período de seguimiento se obtendrán de Medical Explorer y se realizará una llamada telefónica en caso de que falten datos.

Mediciones

• Recuento de glóbulos, incluidas las plaquetas.
• Fosforilación de ACC vía western blotting, ECLIA.
• Extracto proteico de plaquetas para la acetilación de proteínas.
• Función plaquetaria ex vivo mediante análisis multiplaca.
• Muestreo de plasma.
• Análisis de lipidómica de plaquetas. Análisis de fosforilación ACC
• El plasma rico en plaquetas (PRP) se obtendrá después de la centrifugación. Se agregan Apyrase e Integrilin para limitar la activación plaquetaria durante la preparación. El PRP se dividirá en 3 muestras y las plaquetas se sedimentarán después de la centrifugación a 400 g durante 10 minutos.
• Una de las 3 muestras de plaquetas se lisará con solución de Lemli para el análisis de transferencia Western de sustratos fosforilados de ACC, ACC1 y proteína quinasa C fosforilada. A continuación, todas las muestras se almacenarán a -80 °C. Para comparar diferentes inmunotransferencias, se obtienen muestras de plaquetas de control después de la estimulación con trombina. La muestra de plaquetas de cada paciente se comparará con la misma muestra de control. La señal de ACC fosforilada para cada paciente se cuantificará mediante Image J (Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, EE. UU., http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2014) y se expresará como una fracción de la señal de la muestra de control.
• El nivel de ACC fosforilado se confirmará mediante electroquimioluminiscencia (ECLIA, Meso Scale Discovery) y citometría de flujo (FACS).
• Los extractos de proteínas se utilizarán para el análisis de proteínas plaquetarias mediante inmunotransferencia.

Muestreo de plasma

• Marcadores de coagulación que incluyen INR, TCA, TT, PTT, fibrinógeno, dímeros D, complejo de trombina y antitrombina (TAT).
• Mediciones de citocinas (TNF-alfa, IL-1b, IL-6, quimiocinas-CCL 3, 5 y 18, sistema del complemento) así como biomarcadores inflamatorios (proteína C reactiva hipersensible).
• Biomarcadores de activación de plaquetas (sCD62P, sCD40L, CD62P, PF4) (colaboración con el Dr. C. Oury, GIGA, Université de Liège, Bélgica).
• Biomarcadores fibrinolíticos (u-PA, t-PA y PAI).
• lipidómico. Orinas Las muestras de orina se recogerán en los mismos tiempos que las muestras de sangre para medir la generación de TX2B.

Análisis lipidómicos El lipidomo se analizará en colaboración con Christine Des Rosiers en el Montréal Heart Insitute. Se prestará especial atención a los metabolitos de las vías COX y LOX (TXA2 y lipoxinas).

Tamaño de la muestra

Según nuestros datos preliminares, determinamos que la inscripción de un mínimo de 46 pacientes proporcionaría un poder del 90 % a un nivel de significación del 5 % para detectar una diferencia de 0,15 en la fosforilación de ACC (diferencia entre el grupo de control 1 y la población con shock séptico) . Se esperan 20 pacientes en el grupo de control exploratorio.

Covid-19 - Modificación del estudio

Desde diciembre de 2019, el nuevo síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) que causa la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) ha evolucionado de un brote epidémico en China a una pandemia. La infección grave es la principal responsable de la neumonía bilateral, pero los datos emergentes indican que se trata de una enfermedad sistémica que afecta a múltiples sistemas, incluidos el sistema hematopoyético y el inmunitario. Se ha demostrado activación endotelial, estado procoagulante y microtrombosis. Sin embargo, no se ha demostrado que la fisiopatología sea similar a una sepsis bacteriana y la ruta metabólica antes mencionada también debe estudiarse en el subgrupo de pacientes con Covid-19.

El grupo Covid-19 corresponderá a los pacientes ingresados ​​en UCI con SDRA por infección por SARS-Cov-2 y PaO2/FiO2 < 200. La inclusión se realizará dentro de los 5 días posteriores al ingreso y se excluirán los pacientes con coinfección bacteriana. Planeamos inscribir a 46 pacientes, de manera similar al grupo de control y shock séptico.