Estado de fosforilação da acetil-CoA carboxilase de plaquetas em choque séptico (PLACCSEPS)

Fundo

A sepse, uma reação inflamatória sistêmica que ocorre em resposta a uma infecção, é um importante problema de saúde pública e é reconhecida como a principal causa de morte na unidade de terapia intensiva (UTI). Essa reação inflamatória grave causa ativação e disfunção endotelial. Esse fenômeno está intimamente associado à ativação da cascata de coagulação via exposição do fator tecidual (FT) na superfície da célula endotelial. O TF serve de âncora para os fatores de coagulação VII e X permitindo sua ativação. Isso resulta na geração de trombina (IIa) e produção de fibrina.

A trombina também é um potente agonista (ativador) de plaquetas, resultando em ativação e consumo de plaquetas. A atividade pró-coagulante das plaquetas ativadas durante a sepse potencializa a formação de microtromboses que prejudicam a perfusão dos órgãos e podem levar à morte. A trombocitopenia é comum e é um forte marcador de prognóstico negativo em pacientes com choque séptico.

Além da coagulação, sabe-se que as plaquetas desempenham um papel fundamental na inflamação e na resposta imune. A ativação das plaquetas pode ser iniciada pelo endotélio inflamado ou por citocinas inflamatórias circulatórias que, por sua vez, modulam a resposta inflamatória e trombótica. As plaquetas ativadas interagem com as células imunes, como os neutrófilos. Além disso, as plaquetas podem atuar como "sensores" microbianos, expressando membros da família Toll-Like Receptors (TLRs), ligandos ligantes de diversos agentes infecciosos. Dados recentes destacam a interação entre as armadilhas extracelulares (NETs) de plaquetas e neutrófilos. As plaquetas facilitam a formação de NETs e, inversamente, os NETS ativam as plaquetas. Os NETs conectam plaquetas, trombose, resposta imune e inflamação e, portanto, são de particular interesse no contexto séptico.

As plaquetas expressam Acetil-CoA carboxilase 1 (ACC1), que é a enzima da primeira etapa da lipogênese. A fosforilação do ACC na Serina 79 pela proteína quinase ativada por AMP (AMPK) leva à sua inibição e a AMPK é ativada pela trombina. Demonstramos que o eixo AMPK-ACC controla o conteúdo de fosfolipídios plaquetários, que influenciam a liberação de TXA2 e grânulos densos e, por sua vez, a formação de trombos. O TXA2 é gerado a partir de fosfolipídios contendo ácido araquidônico (AA). Alternativamente, o AA pode ser metabolizado pela via da lipooxigenase (LOX) produzindo lipoxinas (LX) e resolvina, que estão bastante envolvidas na resolução da inflamação. A relação entre a sinalização AMPK-ACC e a via da lipooxigenase nunca foi investigada.

Pesquisar hipóteses

Sabendo do aumento dramático na geração de trombina durante a sepse, nossa hipótese de pesquisa é que a fosforilação de ACC induzida por AMPK nas plaquetas é aumentada e que isso pode modular o metabolismo das plaquetas e mais particularmente o conteúdo de mediadores inflamatórios das plaquetas, provenientes de AA e lipídios.

seleção de pacientes

Serão incluídos pacientes consecutivos com choque séptico internados na Cliniques universitaires Saint-Luc, Bruxelas (grupo experimental)

O grupo controle corresponderá a voluntários saudáveis ​​com idade e sexo pareados, com base na análise retrospectiva de pacientes internados em UTI por sepse.

O grupo controle exploratório corresponderá a pacientes admitidos na unidade de terapia intensiva sem evidências de infecção grave e resposta inflamatória sistêmica grave. Pacientes com distúrbios neurológicos e intoxicação serão a população-alvo.

Critérios de exclusão semelhantes serão os mesmos nos grupos de controle e no grupo experimental.

material e métodos

Tipo de estudo Estudo prospectivo, monocêntrico, intervencional.

Coleta de sangue As amostras de sangue serão coletadas após a inserção do cateter venoso, em até 48 horas após o diagnóstico de choque séptico.

As seguintes amostras serão coletadas durante o procedimento:

• Coagulação incluindo (INR, TCA, TT, PTT, Fibrinogênio, DDimers) (1 TUBE verde de 3 ml)
• Análise multiplaca (1 TUBO laranja de 3 ml)
• Amostra de sangue para análise de proteínas plaquetárias (incluindo fosforilação ACC). Após o isolamento das plaquetas, o plasma remanescente será congelado (2 TUBOS CPDA de 8,5 ml).
• Amostra de urina.

Coleta de dados Os dados serão coletados do Medical Explorer e Q Care, incluindo dados biológicos que são realizados rotineiramente em pacientes internados na UTI como contagem de plaquetas, nível de PCR, avaliação de coagulação, função renal e enzimologia hepática. O acompanhamento será realizado por pelo menos 3 anos e nenhuma visita adicional será planejada. Os eventos registrados durante o período de acompanhamento serão obtidos do Medical Explorer e um telefonema será feito em caso de falta de dados.

Medidas

• Contagem de células sanguíneas, incluindo plaquetas.
• Fosforilação de ACC via western blotting, ECLIA.
• Extrato de proteína de plaquetas para acetilação de proteínas.
• Função plaquetária ex vivo usando análise Multiplate.
• Amostragem de plasma.
• Análise lipidômica de plaquetas. Análise de fosforilação ACC
• Plasma rico em plaquetas (PRP) será obtido após centrifugação. Apirase e Integrilin são adicionados para limitar a ativação plaquetária durante a preparação. O PRP será dividido em 3 amostras e as plaquetas serão peletizadas após centrifugação a 400 g por 10 minutos.
• Uma das 3 amostras de plaquetas será lisada com solução de Lemli para análise de Western blot dos substratos fosforilados ACC, ACC1 e proteína quinase C fosforilada. Todas as amostras serão armazenadas a -80°C. A fim de comparar diferentes imunotransferências, amostras de plaquetas de controle são obtidas após estimulação com trombina. A amostra de plaquetas de cada paciente será comparada com a mesma amostra de controle. O sinal de ACC fosforilado para cada paciente será quantificado por Image J (Rasband, W.S., ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, EUA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2014) e será expresso como uma fração do sinal de amostra de controle.
• O nível de ACC fosforilado será confirmado por eletroquimioluminescência (ECLIA, Meso Scale Discovery) e citometria de fluxo (FACS).
• Extratos proteicos serão utilizados para análise de proteínas plaquetárias por imunoblotting.

Amostragem de plasma

• Marcadores de coagulação, incluindo INR, TCA, TT, PTT, fibrinogênio, D-dímeros, complexo trombina antitrombina (TAT).
• Dosagens de citocinas (TNF-alfa, IL-1b, IL-6, quimiocinas - CCL 3, 5 e 18, sistema complemento) e biomarcadores inflamatórios (proteína C reativa hipersensível).
• Biomarcadores de ativação de plaquetas (sCD62P, sCD40L, CD62P, PF4) (colaboração com Dr. C. Oury, GIGA, Université de Liège, Bélgica).
• Biomarcadores fibrinolíticos (u-PA, t-PA e PAI).
• Lipidômico. Urinas Amostras de urina serão coletadas nos mesmos horários que a coleta de sangue para medir a geração de TX2B.

Análises lipidômicas O lipidoma será analisado em colaboração com Christine Des Rosiers no Montréal Heart Insitute. Atenção especial será dada aos metabólitos das vias COX e LOX (TXA2 e lipoxinas).

Tamanho da amostra

Com base em nossos dados preliminares, determinamos que a inscrição de no mínimo 46 pacientes forneceria um poder de 90% a um nível de significância de 5% para detectar uma diferença de 0,15 na fosforilação do ACC (diferença entre o grupo de controle 1 e a população com choque séptico) . São esperados 20 pacientes no grupo de controle exploratório.

Covid-19 - Alteração do estudo

Desde dezembro de 2019, o novo Coronavírus da Síndrome Respiratória Aguda Grave 2 (SARS-CoV-2) que causa a doença de Coronavírus 2019 (COVID-19) evoluiu de um surto epidêmico na China para uma pandemia. A infecção grave é a principal responsável pela pneumonia bilateral, mas dados emergentes indicam que é uma doença sistêmica envolvendo múltiplos sistemas, incluindo o sistema hematopoiético e imunológico. Ativação endotelial, estado pró-coagulante e microtrombose foram demonstrados. No entanto, a fisiopatologia não demonstrou ser semelhante a uma sepse bacteriana e a via metabólica acima mencionada também deve ser estudada no subgrupo de pacientes com Covid-19.

O grupo Covid-19 corresponderá aos pacientes internados na UTI com SDRA por infecção por SARS-Cov-2 e PaO2/FiO2 < 200. A inclusão será feita em até 5 dias após a admissão e os pacientes com co-infecção bacteriana serão excluídos. Planejamos incluir 46 pacientes, semelhante ao grupo controle e choque séptico.