Blodplader Acetyl-CoA-carboxylase-phosphoryleringstilstand i SEPtisk chok (PLACCSEPS)

Baggrund

Sepsis, en systemisk inflammatorisk reaktion, der opstår som reaktion på en infektion, er et stort folkesundhedsproblem og er anerkendt som den førende dødsårsag på intensivafdelingen (ICU). Denne alvorlige inflammatoriske reaktion forårsager endotelaktivering og dysfunktion. Dette fænomen er tæt forbundet med aktiveringen af ​​koagulationskaskaden via eksponering af vævsfaktor (TF) ved endotelcelleoverfladen. TF tjener som et anker for koagulationsfaktorer VII og X, hvilket tillader deres aktivering. Dette resulterer i dannelse af thrombin (IIa) og fibrinproduktion.

Thrombin er også en potent blodpladeagonist (aktivator), hvilket resulterer i blodpladeaktivering og -forbrug. Den pro-koagulerende aktivitet af aktiverede blodplader under sepsis øger dannelsen af ​​mikro-trombose, der hæmmer organperfusion og kan føre til døden. Trombocytopeni er almindelig og er en stærk negativ prognostisk markør hos patienter med septisk shock.

Ud over koagulation er blodplader kendt for at spille en nøglerolle i inflammation og immunrespons. Blodpladeaktivering kan initieres af betændt endotel eller cirkulatoriske inflammatoriske cytokiner, som igen modulerer den inflammatoriske og trombotiske respons. Aktiverede blodplader interagerer med immunceller, som neutrofiler. Desuden kan blodplader fungere som mikrobielle "sensorer" ved at udtrykke medlemmer af Toll-Like Receptors (TLR'er) familie, der binder ligander fra flere infektiøse agenser. Nylige data fremhæver samspillet mellem blodplader og neutrofile ekstracellulære fælder (NET). Blodplader letter dannelsen af ​​NET, og omvendt aktiverer NETS blodplader. NET forbinder blodplader, trombose, immunrespons og inflammation og er derfor af særlig interesse i septisk sammenhæng.

Blodplader udtrykker Acetyl-CoA carboxylase 1 (ACC1), som er det første trins enzym i lipogenese. ACC-phosphorylering på Serine 79 med AMP-aktiveret proteinkinase (AMPK) fører til dets hæmning, og AMPK aktiveres af thrombin. Vi demonstrerede, at AMPK-ACC-aksen kontrollerer indholdet af blodpladers fosfolipider, som påvirker TXA2 og tæt granulatfrigivelse og igen trombedannelse. TXA2 genereres ud fra fosfolipider indeholdende arachidonsyre (AA). Alternativt kan AA metaboliseres af lipooxygenase (LOX) pathway, der producerer lipoxiner (LX) og resolvin, som snarere er involveret i opløsningen af ​​inflammation. Forholdet mellem AMPK-ACC-signalering og lipooxygenase-vejen er aldrig blevet undersøgt.

Forskningshypotese

Ved at kende den dramatiske stigning i thrombingenerering under sepsis, er vores forskningshypotese, at AMPK-induceret ACC-phosphorylering i blodplader er øget, og at dette kan modulere blodplademetabolisme og mere specifikt indholdet af blodplader inflammatoriske mediatorer, der kommer fra AA og lipider.

Patientvalg

Konsekutive patienter med septisk shock indlagt på Cliniques universitaires Saint-Luc, Bruxelles, vil blive inkluderet (eksperimentel gruppe)

Kontrolgruppen vil svare til raske frivillige med matchet alder og køn, baseret på retrospektiv analyse af patienter indlagt på ICU for sepsis.

Eksplorativ kontrolgruppe vil svare til patienter indlagt på intensivafdelingen uden tegn på alvorlig infektion og alvorlig systemisk inflammatorisk respons. Patienter med neurologisk lidelse og forgiftning vil være målgruppen.

Lignende udelukkelseskriterier vil være de samme i kontrolgrupper som i forsøgsgruppen.

materialer og metoder

Undersøgelsestype Prospektiv, monocentrisk, interventionel undersøgelse.

Blodprøvetagning Blodprøver vil blive udtaget efter venekateterindsættelse inden for 48 timer efter septisk shockdiagnose.

Følgende prøver vil blive taget under proceduren:

• Koagulation inklusive (INR, TCA, TT, PTT, Fibrinogen, DDimerer) (1 grønt RØR på 3 ml)
• Multipladeanalyse (1 orange RØR á 3 ml)
• Blodprøve til blodpladeproteinanalyse (inklusive ACC-phosphorylering). Efter blodpladeisolering vil det resterende plasma blive frosset (2 RØR CPDA på 8,5 ml).
• Urinprøve.

Dataindsamling Data vil blive indsamlet fra Medical Explorer og Q Care, herunder biologiske data, der rutinemæssigt udføres hos patienter indlagt på intensivafdelingen som trombocyttal, CRP-niveau, koagulationsvurdering, nyrefunktion og leverenzymologi. Opfølgning vil blive udført i mindst 3 år, og der vil ikke blive planlagt yderligere besøg. Hændelser registreret i opfølgningsperioden vil blive indhentet fra Medical Explorer, og et telefonopkald vil blive foretaget i tilfælde af manglende data.

Målinger

• Antal blodlegemer inklusive blodplader.
• ACC-phosphorylering via western blotting, ECLIA.
• Blodpladeproteinekstrakt til proteinacetylering.
• Blodpladefunktion ex vivo ved hjælp af multipladeanalyse.
• Plasmaprøvetagning.
• Blodplader lipidomic analyse. ACC-phosphoryleringsanalyse
• Plasma-rige blodplader (PRP) vil blive opnået efter centrifugering. Apyrase og Integrilin tilsættes for at begrænse blodpladeaktivering under tilberedning. PRP vil blive opdelt i 3 prøver, og blodplader vil blive pelleteret efter centrifugering ved 400 g i 10 minutter.
• En af de 3 blodpladeprøver vil blive lyseret med Lemli-opløsning til Western blot-analyse af phosphoryleret ACC, ACC1 og phosphoryleret proteinkinase C-substrater. Alle prøver vil derefter blive lagerført ved -80°c. For at sammenligne forskellige immunblotting opnås kontrolblodpladeprøver efter thrombinstimulering. Hver patients blodpladeprøve vil blive sammenlignet med den samme kontrolprøve. Signalet for phosphoryleret ACC for hver patient vil blive kvantificeret af Image J (Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2014) og vil blive udtrykt som en brøkdel af kontrolprøvesignalet.
• Niveauet af phosphoryleret ACC vil blive bekræftet ved elektrokemiluminescens (ECLIA, Meso Scale Discovery) og flowcytometri (FACS).
• Proteinekstrakter vil blive brugt til blodpladeproteinanalyse ved hjælp af immunblotting.

Plasmaprøvetagning

• Koagulationsmarkører inklusive INR, TCA, TT, PTT, Fibrinogen, D-Dimerer, Thrombin antithrombin kompleks (TAT).
• Cytokinmålinger (TNF-alfa, IL-1b, IL-6, kemokiner- CCL 3, 5 og 18, komplementsystem) samt inflammatoriske biomarkører (overfølsomt C-reaktivt protein).
• Blodpladeaktiveringsbiomarkører (sCD62P, sCD40L, CD62P, PF4) (samarbejde med Dr. C. Oury, GIGA, Université de Liège, Belgien).
• Fibrinolytiske biomarkører (u-PA, t-PA og PAI).
• Lipidomisk. Urin Prøver af urin vil blive indsamlet på samme tidspunkt som blodprøvetagning for at måle TX2B-generering.

Lipidomiske analyser Lipidome vil blive analyseret i samarbejde med Christine Des Rosiers i Montréal Heart Insitute. Særlig opmærksomhed vil blive givet til metabolitter fra COX- og LOX-vejene (TXA2 og lipoxiner).

Prøvestørrelse

Baseret på vores foreløbige data fastslog vi, at indskrivning af minimum 46 patienter ville give en styrke på 90 % ved et signifikansniveau på 5 % til at påvise en forskel på 0,15 i phosphoryleringen af ​​ACC (forskel mellem kontrolgruppe 1 og septisk chokpopulation) . Der forventes 20 patienter i den eksplorative kontrolgruppe.

Covid-19 - Undersøgelsesændring

Siden december 2019 har det nye alvorlige akutte respiratoriske syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), der forårsager Coronavirus sygdom 2019 (COVID-19), udviklet sig fra et epidemiudbrud i Kina til en pandemi. Alvorlig infektion er hovedsageligt ansvarlig for bilateral lungebetændelse, men nye data indikerer, at det er en systemisk sygdom, der involverer flere systemer, herunder det hæmatopoietiske system og immunsystemet. Endotelaktivering, prokoagulerende tilstand og mikrotrombose er blevet vist. Patofysiologien er dog ikke blevet påvist at ligne en bakteriel sepsis, og den ovennævnte metaboliske vej bør også undersøges i undergruppen af ​​Covid-19 patienter.

Covid-19-gruppen vil svare til patienter indlagt på intensivafdelingen med ARDS på grund af SARS-Cov-2-infektion og PaO2/FiO2 < 200. Inklusion vil ske inden for 5 dage efter indlæggelse og patienter med bakteriel co-infektion vil blive udelukket. Vi planlagde at inkludere 46 patienter, svarende til kontrolgruppen og septisk shockgruppen.