SEPtic 쇼크에서 PLatelets 아세틸-CoA 카르복실라제 인산화 상태 (PLACCSEPS)

배경

감염에 대한 반응으로 발생하는 전신 염증 반응인 패혈증은 주요 공중 보건 문제이며 중환자실(ICU)에서 사망의 주요 원인으로 인식되고 있습니다. 이 심각한 염증 반응은 내피 활성화 및 기능 장애를 유발합니다. 이 현상은 내피 세포 표면에서 조직 인자(TF)의 노출을 통한 응고 캐스케이드의 활성화와 밀접한 관련이 있습니다. TF는 응고 VII 및 X 인자의 활성화를 허용하는 앵커 역할을 합니다. 이로 인해 트롬빈(IIa) 생성 및 피브린 생성이 발생합니다.

트롬빈은 또한 강력한 혈소판 작용제(활성화제)로 혈소판 활성화 및 소모를 유발합니다. 패혈증 동안 활성화된 혈소판의 전응고 활성은 장기 관류를 손상시키고 사망으로 이어질 수 있는 미세혈전증의 형성을 강화합니다. 혈소판 감소증은 일반적이며 패혈성 쇼크 환자에서 강력한 음성 예후 표지자입니다.

응고 외에도 혈소판은 염증과 면역 반응에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다. 혈소판 활성화는 염증이 생긴 내피 또는 순환계 염증 사이토카인에 의해 시작될 수 있으며, 이는 차례로 염증 및 혈전 반응을 조절합니다. 활성화된 혈소판은 호중구와 같은 면역 세포와 상호 작용합니다. 또한 혈소판은 여러 감염원의 리간드를 결합하는 Toll-Like Receptors(TLRs) 패밀리의 구성원을 표현함으로써 미생물 "센서" 역할을 할 수 있습니다. 최근 데이터는 혈소판과 호중구 세포외 트랩(NET) 사이의 상호 작용을 강조합니다. 혈소판은 NET 형성을 촉진하고 반대로 NETS는 혈소판을 활성화합니다. NET은 혈소판, 혈전증, 면역 반응 및 염증을 연결하므로 패혈증 상황에서 특히 중요합니다.

혈소판은 지방 생성의 첫 단계 효소인 아세틸-CoA 카르복실라제 1(ACC1)을 발현합니다. AMP-활성화 단백질 키나아제(AMPK)에 의한 세린 79의 ACC 인산화는 억제를 일으키고 AMPK는 트롬빈에 의해 활성화됩니다. 우리는 AMPK-ACC 축이 TXA2 및 조밀한 과립 방출에 영향을 미치고 차례로 혈전 형성에 영향을 미치는 혈소판 인지질 함량을 제어한다는 것을 입증했습니다. TXA2는 아라키돈산(AA)을 포함하는 인지질에서 생성됩니다. 대안적으로, AA는 리폭신(LX) 및 리졸빈을 생성하는 리포옥시게나제(LOX) 경로에 의해 대사될 수 있으며, 이들은 오히려 염증의 해소에 관여한다. AMPK-ACC 신호와 lipooxygenase 경로 사이의 관계는 조사된 적이 없습니다.

연구 가설

패혈증 동안 트롬빈 생성의 극적인 증가를 알고 있는 우리의 연구 가설은 혈소판에서 AMPK 유도 ACC 인산화가 증가하고 이것이 혈소판 대사, 특히 AA 및 지질에서 오는 혈소판 염증 매개체 함량을 조절할 수 있다는 것입니다.

환자 선택

Cliniques universitaires Saint-Luc, Brussels에 입원한 패혈성 쇼크 연속 환자 포함(실험군)

대조군은 패혈증으로 ICU에 입원한 환자의 후향적 분석을 기반으로 나이와 성별이 일치하는 건강한 지원자에 해당합니다.

탐색적 대조군은 중증 감염 및 중증 전신 염증 반응의 증거 없이 중환자실에 입원한 환자에 해당합니다. 신경 장애 및 중독 환자가 대상 인구가 될 것입니다.

유사한 배제 기준은 실험군보다 대조군에서 동일할 것이다.

재료 및 방법

연구 유형 전향적, 단일 중심적, 중재적 연구.

채혈 패혈성 쇼크 진단 후 48시간 이내에 정맥 카테터 삽입 후 채혈합니다.

절차 중에 다음 샘플을 채취합니다.

• (INR, TCA, TT, PTT, 피브리노겐, DDimers)를 포함한 응고(3ml의 녹색 TUBE 1개)
• 다중 플레이트 분석(3ml의 주황색 TUBE 1개)
• 혈소판 단백질 분석을 위한 혈액 샘플(ACC 인산화 포함). 혈소판 분리 후 남은 혈장은 동결됩니다(8.5ml의 2 TUBES CPDA).
• 소변 샘플.

데이터 수집 데이터는 혈소판 수, CRP 수준, 응고 평가, 신장 기능 및 간 효소와 같이 ICU에 입원한 환자에서 일상적으로 수행되는 생물학적 데이터를 포함하여 Medical Explorer 및 Q Care에서 수집됩니다. 추적관찰은 최소 3년 후에 실시할 것이며 추가 방문은 계획하지 않을 것입니다. 추적 기간 동안 기록된 이벤트는 Medical Explorer에서 가져오고 데이터가 누락된 경우 전화 통화가 이루어집니다.

측정

• 혈소판을 포함한 혈액 세포 수.
• Western blotting, ECLIA를 통한 ACC 인산화.
• 단백질 아세틸화를 위한 혈소판 단백질 추출물.
• Multiplate 분석을 사용하여 ex vivo 혈소판 기능.
• 플라즈마 샘플링.
• 혈소판 지질체학 분석. ACC 인산화 분석
• PRP(Plasma-rich-platelet)는 원심분리 후 얻을 수 있습니다. Apyrase와 Integrilin은 준비 중에 혈소판 활성화를 제한하기 위해 추가됩니다. PRP는 3개의 샘플로 나누어지고 혈소판은 400g에서 10분 동안 원심분리한 후 펠릿화됩니다.
• 3개의 혈소판 샘플 중 하나는 인산화된 ACC, ACC1 및 인산화된 단백질 키나아제 C 기질의 웨스턴 블롯 분석을 위해 Lemli 용액으로 용해됩니다. 그런 다음 모든 샘플은 -80°c에서 비축됩니다. 상이한 면역블롯팅을 비교하기 위해, 트롬빈 ​​자극 후에 대조군 혈소판 샘플을 얻었다. 각 환자의 혈소판 샘플은 동일한 대조군 샘플과 비교됩니다. 각 환자에 대한 인산화된 ACC의 신호는 Image J(Rasband, W.S., ImageJ, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2014) 제어 샘플 신호의 일부로 표시됩니다.
• 인산화된 ACC의 수준은 전기화학발광(ECLIA, Meso Scale Discovery) 및 유동 세포측정법(FACS)에 의해 확인될 것이다.
• 단백질 추출물은 immunoblotting을 사용하여 혈소판 단백질 분석에 사용됩니다.

플라즈마 샘플링

• INR, TCA, TT, PTT, 피브리노겐, D-다이머, 트롬빈 ​​항트롬빈 복합체(TAT)를 포함한 응고 마커.
• 사이토카인 측정(TNF-알파, IL-1b, IL-6, 케모카인-CCL 3, 5 및 18, 보체 시스템) 및 염증성 바이오마커(과민성 C-반응성 단백질).
• 혈소판 활성화 바이오마커(sCD62P, sCD40L, CD62P, PF4)(Dr. C. Oury, GIGA, Université de Liège, 벨기에와의 협력).
• 섬유소용해 바이오마커(u-PA, t-PA 및 PAI).
• 지질. 소변 TX2B 생성을 측정하기 위해 혈액 샘플링과 동일한 시간에 소변 샘플을 수집합니다.

지질 분석 Lipidome은 Montréal Heart Insitute의 Christine Des Rosiers와 공동으로 분석할 것입니다. COX 및 LOX 경로(TXA2 및 리폭신)의 대사산물에 특별한 주의를 기울일 것입니다.

표본의 크기

예비 데이터를 기반으로 최소 46명의 환자를 등록하면 ACC의 인산화에서 0.15의 차이(대조군 1과 패혈성 쇼크 모집단 간의 차이)를 감지하기 위해 5%의 유의 수준에서 90%의 검정력을 제공한다고 결정했습니다. . 탐색적 대조군에는 20명의 환자가 예상된다.

Covid-19 - 연구 수정안

2019년 12월 이후 코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)를 유발하는 신종 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)는 중국에서 발생한 전염병 발생에서 팬데믹으로 발전했습니다. 심한 감염은 주로 양측성 폐렴의 원인이 되지만 새로운 데이터에 따르면 조혈 및 면역 체계를 포함한 여러 시스템을 포함하는 전신 질환임을 나타냅니다. 내피 활성화, 응고 촉진 상태 및 미세혈전증이 나타났습니다. 그러나 병리생리학은 세균성 패혈증과 유사한 것으로 입증되지 않았으며 위에서 언급한 대사 경로도 Covid-19 환자의 하위 그룹에서 연구되어야 합니다.

Covid-19 그룹은 SARS-Cov-2 감염 및 PaO2/FiO2 < 200으로 인해 ARDS로 ICU에 입원한 환자에 해당합니다. 포함은 입원 후 5일 이내에 완료되며 세균 동시 감염 환자는 제외됩니다. 대조군 및 패혈성 쇼크 그룹과 유사하게 46명의 환자를 등록할 계획이었습니다.