糖尿病におけるPPAR、RXR、およびVDRの発現

現在の研究プロトコルは、トカット ガジオスマンパシャ大学の医療倫理委員会の倫理委員会によって承認されました。 この研究は、横断的な臨床研究として設計され、トカット・ガジオスマンパシャ大学歯学部歯周病学科で実施されました。 すべての参加者からインフォームド コンセントが得られ、経験豊富な臨床医 (H.B.Y.) によって詳細な口頭および放射線検査が行われました。

42 人の参加者 (各グループに 14 人の参加者) が研究に登録されました。 研究会は以下の通り。

健康なコントロール (C、平均年齢 41.05±1.80、 男性 7 名、女性 7 名) ステージ 3 のグレード B の歯周病患者 (P、平均年齢 42.35±1.92、 男性7名、女性7名） ステージ3グレードCの糖尿病および歯周炎患者（DP、平均年齢41.09±1.28、 男性7名、女性7名）

すべての患者と健康な個人は詳細な口頭検査を受け、歯周病と歯周炎の診断は、歯周病と状態の分類のための 2017 年国際世界ワークショップで歯周病の健康と疾患の最近の分類によって定義された基準に基づいていました [21]。 .

参加者全員が喫煙者ではありませんでした。 除外基準は、炎症状態に影響を与える可能性のある状態、10 未満またはそれ以上の欠損歯の存在、タバコまたは薬物の使用、妊娠または授乳の存在、および過去 6 か月以内の抗生物質または歯周治療の存在でした。 本研究の糖尿病患者は、糖尿病治療を受けていたにもかかわらず、HbA1c 値が 7.0 を超えていました。 また、HbA1c値が7.0未満の糖尿病患者は含まれていませんでした。

臨床測定 臨床パラメーターは、プラーク指数 (PI)、歯肉指数 (GI)、および臨床的付着レベル (CAL) であり、すべての分析は生検手順の前に実行されました。 口全体の測定値と関連する歯の測定値は別々に記録されました。 CAL は、セメントとエナメルの接合部から歯周ポケットの底まで測定され、ウィリアムズ型の歯周プローブが測定に使用されました (Hu-Friedy Co.、Chicago、IL、USA)。 PIおよびGI測定は、エクスプローラー（Hu-Friedy Co.、シカゴ、イリノイ州、米国）を介して実行されました。 すべての分析は、両方の歯の近心、中間、および遠心部位として、頬側面から 3 つ、口蓋側面から 3 つの 6 つのポイントから実行されました。 ６回の測定の平均値を記録した。

歯肉サンプルの収集 歯肉生検は、以前の研究 [22] のプロトコルに従って得られました。 各参加者から 2 つの歯肉生検が得られました。 歯周病の健康な個人の歯肉サンプリングは、通常の治療プロトコルでの歯冠延長手順によって、または歯列矯正で示された抜歯の前に行われました。 歯周炎群では、歯周組織の炎症を起こした歯肉組織から生検材料を採取し、歯周外科手術を行った。 すべての生検は後上顎歯 (歯 #4、#5、#6 または #7) から得られました。

まず、局所麻酔が行われ、歯肉のトポグラフィーが損なわれている患者からの歯肉切除術/歯冠延長処置が必要な領域、または健康な個人の矯正治療が必要な抜歯前の領域から歯肉サンプルが組織ハサミで解剖されました。 歯周炎患者に関しては、重度の歯肉炎症を伴う歯肉領域からのスケーリングおよびルートプランニング手順中に、組織ハサミを使用して歯肉サンプルを解剖しました。 各参加者からの 1 つの歯肉サンプルは、すぐに 10% 中性緩衝ホルマリンに 48 時間入れられ、組織学的処理を受けました。 各参加者の他のサンプルは、分析日まで-80⁰Cで直ちに凍結されました。

組織病理学的評価 すべての組織学的手順は、経験豊富な盲目の研究者 (F.G.) によって行われました。 組織学的組織処理を受けた歯肉サンプルは、最初にホルマリンから洗浄および洗浄され、一連のアルコールで脱水されました。 次に、すべての組織をキシレンで透明にし、パラフィンブロックに包埋しました。 各ブロック全体を連続切片として切断し、各ブロックから 3 つの切片をヘマトキシリン-エオジン (H&E) 染色用に選択しました。 線維芽細胞および炎症細胞の浸潤は、光学顕微鏡を介して1000倍の倍率でH&E染色スライドから評価されました。

線維芽細胞および炎症細胞の評価のために、歯肉上皮に隣接する結合組織境界の歯肉領域を評価した。 1000 倍の倍率で 10.000 µm2 面積の細胞計数フレームを選択しました。 フレーム内の全炎症細胞（好中球、リンパ球、好酸球、マクロファージ細胞）を炎症細胞計数として計数した。 線維芽細胞も同様に数えた。 測定は 3 つの異なるポイントから実行され、これら 3 つの測定値の平均が記録されました [23]。

PPAR-γ、RXR-α、および VDR 免疫組織化学 免疫組織化学は、以前の研究 [23-26] で報告されているように実行されました。 各参加者からの免疫組織化学染色ごとに3つのセクションが選択されました。 まず、すべてのスライドを脱パラフィンし、アルコール系列で脱水しました。 蒸留水で洗浄した後、クエン酸ナトリウム緩衝液 (pH 6.0) を介して 70°C で 2 時間抗原賦活化を行い、3% 過酸化水素処理で内因性ペルオキシダーゼ活性を抑制しました。 過酸化水素処理後、すべてのスライドを通常のウサギ血清で 30 分間インキュベートしました。 通常の血清インキュベーションの後、一次抗体希釈液を調製し、4℃の加湿チャンバーで一晩サンプルに適用しました。 一次抗体は、ヤギ ポリクローナル抗 PPAR-γ 抗体 (1:250)、抗 RXR-α 抗体 (1:250)、および抗 VDR 抗体 (1:250) でした。 一次抗体のインキュベーション後、すべてのスライドをリン酸緩衝液 (PBS) で 5 分間 (3x5) 3 回洗浄し、ビオチン化免疫グロブリン G を 30 分間適用しました。 再度 3x5 PBS で洗浄し、すべてのサンプルをストレプトアビジン-ホースラディッシュ ペルオキシダーゼ結合試薬にさらに 30 分間さらしました。 3x5 PBS で洗浄した後、染色を視覚化するためにすべてのセクションを AEC 色原体で処理しました。 マイヤーのヘマトキシリンで対比染色を行い、切片をマウントしました。 2 日間乾燥させた後、サンプルを光学顕微鏡を使用して 400 倍の倍率で検査しました [23、24]。

免疫組織化学的半定量的 H スコア分析 免疫組織化学的評価は、各セクションの 3 つの異なる領域で実行され、各患者について 3 つのセクションが評価されました。 各参加者に対して 9 回の測定が行われました。 すべての細胞は、染色なし「0」、低染色「1」、軽度の染色「2」、および密な染色「3」として染色に従ってマークされました。 染色スコアは、免疫組織化学で頻繁に使用される値である式 (ΣPi(i+1)) によって「H スコア」として数値に変換されました [23、24]。 この式では、i は染色強度スコアを示し、Pi: は染色された細胞のパーセンテージを示します。

RT-PCR 分析 遺伝子に使用するプライマーを表 1 に示しました。 RNA 分離と RT-PCR 分析は、以前の研究 [27] に従って実行されました。 簡単に言えば、RT-PCR分析のために、最初の歯肉組織をホモジナイズし、超音波処理して組織中のRNAを明らかにし、組織上清を得ました。 次いで、上清を全ｍＲＮＡ単離工程にかけた。 組織をキアゾールで処理し、シェーカーで 5 分間インキュベートしました。 ５分後、細胞を含む培地にクロロホルムを加え、室温で３分間インキュベーションを続け、次いでサンプルを遠心分離した。 遠心分離機の最後に、チューブの上部にある上清を別のチューブに移しました。 その後、イソプロパノールを上清に添加し、室温で10分間インキュベートし、遠心分離ステップを繰り返しました。 遠心分離の最後に、底に沈殿したペレットを 75% エタノールで洗浄し、残った上清を再度遠心分離し、RNase を含まない純粋な滅菌水に懸濁しました。 mRNAは分光測光法によって決定されました。 次に、qRT-PCR キットを使用して、目的の遺伝子をターゲットとする特定のプライマーを使用して 1 μg の mRNA をシングルステップ cDNA に変換し、その後、qRT-PCR を使用して遺伝子を同定しました (Verso、Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州、米国)。 . 結果は、β-アクチンコントロール遺伝子に対して正規化されました。

統計分析 この研究の検出力は、同様の研究デザインによる以前の研究に基づいて 85% 以上でした [25]。 統計分析には IBM SPSS ソフトウェアを使用しました。 正規性の検定には、1 サンプル K-S 検定が使用されました。 線維芽細胞数、炎症細胞数、および CAL については、One Way ANOVA に続いて Tukey 検定を使用しました。 その他のパラメーターについては、マン ホイットニーの U 検定とクルスカル ウォリスの検定を使用しました。 データは、必要に応じて平均±SDまたはパーセンテージとして提示されました。 p < 0.05 は統計的に有意と見なされました。